Die Rolle von Cytochrom P450-abgeleiteten Eicosanoiden in der Pathogenese der pulmonalen Hypertonie des Menschen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel dieses Forschungsprojektes war, mit der von dem Antragsteller entwickelten hochempfindlichen kapillarchromatographisch-UV- spektrometrisch-massenspektrometrischen Methode (CapLC-PDAD-MS/MS) das Wirkungsprofil der Arachidonsäure (AA)/Cytochrom P450 (CYP)-abgeleiteten Epoxyeicosatriensäuren (EET) im Kontext aller Mediatoren der AA-Kaskade in der Lunge unter Hypoxie (HYX) vs. Normoxie (NOX) zu untersuchen, um aufgrund der Wechselbeziehung zwischen Konzentration und Vasoaktivität der EET, die Rolle dieser Botenstoffe in der akuten und anhaltenden hypoxieinduzierten pulmonalen Vasokonstriktion (HPV) sowie in der Pathogenese der chronischen hypoxieinduzierten pulmonalen Hypertonie (PH) zu entschlüsseln und auf dieser Basis ein effizientes Therapiekonzept zur Behandlung der PH vorzuschlagen. Das in der einschlägigen Literatur der letzten 17 Jahre vertretene bisherige Paradigma, dass die EET CYP2C-abgeleitete vasokonstriktive Verstärker der HPV sind, wurde durch Versuche mit Applikation der vier exogenen EET Regioisomere am Modell der isoliert perfundierten und ventilierten Mauslunge (IML) unter HYX (1% O2) vs. NOX überprüft. Das Ergebnis war unerwartet: Entgegen der bisherigen Lehrmeinung, erwiesen sich alle vier EET Regioisomere als vasodilatative, die HPV abschwächende Mediatoren (vasodilatative Wirkungsrangordnung: 5,6-EET > 8,9-EET > 11,12-EET > 14,15-EET), was einem Paradigmawechsel gleichkommt. Somit stellte sich die Aufgabe, das neue Paradigma, demzufolge die EET vasodilatative Antagonisten der HPV sind, durch Untersuchung der hypoxiebedingten vasoregulativen Wirkung endogener EET auf die HPV zu verifizieren. Bemerkenswerterweise, zeigte der Einsatz unserer CapLC-PDAD-MS/MS-Technik am Modell der IML sowie bei Ganztierversuchen am Modell der hypoxieinduzierten PH der Maus eine Abnahme der EET-Konzentrationen unter akuter, anhaltender bzw. chronischer HYX vs. NOX, im Gegensatz zu dem alten Paradigma, demzufolge die EET-Konzentrationen unter HYX vs. NOX ansteigen. Darüber hinaus, wurde eine Konzentrationsreduzierung der EET unter akuter und anhaltender HYX vs. NOX in pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (mPASMC) nicht aber in pulmonalarteriellen Endothelzellen (mPAEC) registriert. Aus der hypoxieinduzierten Konzentrationsabnahme der vasodilatativen EET unter HYX vs. NOX folgt, daß, umgekehrt, durch Erhöhung der endogenen EET-Konzentrationen eine Abschwächung der HPV zu erwarten ist. Tatsächlich, konnte die Rolle der EET als Gegenspieler der HPV durch Hervorhebung (highlighting) des Zusammenhanges zwischen endogener EET-Konzentration und vasodilatativer Abschwächung der HPV mittels anfänglicher (ab initio/a.i.) Applikation der gemeinsamen Vorgängersubstanz/precursor AA (a.i. AA) bestätigt werden: Die Antagonisierung der HPV erfolgte in Abhängigkeit von der a.i. AA-Konzentration und dem daraus resultierenden Anstieg der EET- Biosynthese, bis hin zur vollständigen Aufhebung der HPV. Zur Spezifizierung der Korrelation zwischen den Konzentrationen endogener EET und und ihrer vasoregulativen Wirkung auf die HPV wurden Untersuchungen mit Inhibitoren der löslichen EET-abbauenden Epoxidhydrolase (sEH) und CYP-Inhibitoren durchgeführt. Die Applikation der sEH-Inhibitoren TPPU und CAY10640 am Modell der IML mit und ohne highlighting durch a.i. AA-Applikation bewirkte eine deutliche Abschwächung der HPV bei gleichzeitigem Anstieg der endogenen EET-Konzentrationen, wodurch die durch Applikation exogener EET aufgezeigte Rolle der EET als vasodilatative Antagonisten der HPV bestätigt wurde. Die Applikation der in der Literatur als typische Inhibitoren von Epoxygenasen der CYP2C-Subfamilie (2C9, 2C11, 2C29) angeführten Agenzien MS-PPOH, Sulfaphenazol und Fenbendazol zeigte keine Wirkung, weder auf die EET-Biosynthese noch auf die HPV, ein Beleg dafür, dass die Epoxygenasen der CYP2C-Subfamilie, entgegen dem bisherige Paradigma, nicht zuständig sind für die Biosynthese der vasoregulativ auf die HPV wirkenden EET. Tatsächlich, bestätigten Untersuchungen mit IML von CYP2C-knockout-Mäusen, daß die Isoenzyme der CYP2C-Subfamilie keine bestimmende Wirkung auf die HPV aufweisen. In Übereinstimmung damit, haben RT-qPCR-Expressionsmessungen von CYP-Isoformen in pulmonalartriellen Zellen unter chronischer HYX vs. NOX gezeigt, dass keine maßgebenden hypoxieinduzierten Expressionsänderungen bei Isoformen der CYP2C- Subfamilie zu verzeichnen sind, ein weiterer Beweis, daß die Epoxygenasen der CYP2C-Subfamilie keine bestimmende Rolle spielen in der vasoregulativen Modulation der HPV. Zur Findung der HPV-modulierenden Epoxygenase, wurde das systematische screening einer breitgefächerten Auswahl von CYP-Inhibitoren durchgeführt, indem ihre vasoregulative Wirkung auf die HPV in Korrelation mit ihrer inhibitorischen Wirkung auf die EET-Biosynthese untersucht wurde. Von den überprüften Inhibitoren war der hochselektive CYP1-Inhibitor TMS der einzige, der sowohl die EET-Biosynthese gehemmt hat als auch zeitgleich auf die HPV wirkte, und zwar die HPV verstärkend, wodurch eine vasodilatative, die HPV antagonisierende Wirkung der EET bestätigt wurde. Die Verstärkung dieser Wirkung durch den Einsatz von TMS nach a.i. AA-Applikation (highlighting) bestätigte, in Übereinstimmung mit den vorhergehenden EET-Applikations-, a.i. AA- und sEH-Inhibitor-Versuchen, eine vasodilatative, die HPV antagonisierende Wirkung der EET und war, aufgrund der hohen und exklusiven, weil doppelten Selektivität von TMS gegenüber CYP1b1 (Inhibition der CYP1b1-Enzymaktivität mit IC50 = 6 nM und CYP1b1-Expressionsuppression) und chemischen Stabilität von TMS, ein klarer Beleg dafür, dass für die Biosynthese der EET eine Epoxygenase der CYP1-Familie, insbesondere CYP1b1, zuständig ist. Die Identität von CYP1b1 als HPV-modulierende Epoxygenase wurde bestätigt durch die mittels RT-qPCR gemessene dramatische Suppression der CYP1b1-Expression unter chronischer HYX vs. NOX in mPASMC nicht aber in mPAEC, in kausaler Übereinstimmung mit der mittels CapLC-PDAD-MS/MS-Messungen registrierten Abnahme der EET-Konzentrationen in mPASMC nicht aber in mPAEC, in Versuchen am Modell der IML und bei Ganztierversuchen am Modell der hypoxieinduzierten PH der Maus unter akuter, anhaltender bzw. chronischer HYX vs. NOX. Unser Befund, demzufolge sowohl die hypoxieinduzierte CYP-Expressionsabnahme als auch die Unterdrückung der Biosynthese vasodilatativer, die HPV antagonisierender EET in allen Hypoxiephasen (akute, anhaltende und chronische HYX), nur in PASMC nicht aber in PAEC erfolgt, ist in Übereinstimmung mit der Tatsache, dass bekanntlich sowohl die CYP-vermittelte Biosynthese als auch der sEH- vermittelte Abbau der EET, d.h., das AA/CYP/EET/sEH-System insgesamt hauptsächlich in den PASMC lokalisiert ist und hypoxieabhängig reguliert wird. Da dieselben mPASMC sowohl O2-Sensor- als auch Effektorzellen der HPV sind, folgt, dass in ein und derselben Zellart, nämlich den mPASMC sinnvollerweise eine hocheffiziente weil instantane hypoxieabhängige Modulation der HPV durch das AA/CYP/EET/sEH-Mediatorensystem stattfindet. Aufgrund unserer Ergebnisse, erfolgt die Regulation der HPV durch die EET nach folgendem neuen Paradigma: Unter HYX vs. NOX sinken die Konzentrationen vasodilatativer EET, wodurch unter normalphysiologischen Bedingungen akuter HPV der optimale Gasaustausch durch vasokonstriktive Anpassung des Butflusses/der Perfusion an die Sauerstoffversorgung/Ventilationsbedingungen (von Euler-Liljestrand-Mechanismus) sinnvollerweise nicht beeinträchtigt wird. Unter Bedingungen pathophysiologischer anhaltender HPV bzw. chronischer hypoxieinduzierter PH besteht allerdings die Notwendigkeit, der generalisierten Vasokonstriktion durch Anhebung der Konzentration vasodilatativer EET entgegenzuwirken, indem der hydrolytische Abbau der EET durch den Einsatz von sEH-Inhibitoren angehalten wird. D.h., aus dem biochemisch-physiologischen Paradigmawechsel betreffend die vasodilatative Wirkung der EET auf die HPV resultiert ein entsprechender klinischer Paradigmawechsel in der Behandlung der anhaltenden HPV bzw. chronischen hypoxieinduzierten PH. Somit kann das praktisch unrealisierbare bisherige klinische Paradigma basierend auf der Konzentrationsreduzierung (angeblich) vasokonstriktiver EET durch den Einsatz wenig selektiver CYP Inhibitoren in hohen nebenwirkungslastigen Konzentrationen (Mikromolarbereich) nun ersetzt werden durch ein gleichermaßen einfaches wie hocheffizientes neue therapeutische Paradigma: Da aufgrund unserer Befunde die EET in der Lunge, wie auch in allen anderen Bereichen, antiinflammatorische Vasodilatatoren, also Antagonisten der HPV sind, können die in minimaler Dosis (Picomolarbereich) wirkenden hochselektiven und non-toxischen Inhibitoren der EET-abbauenden sEH als hocheffektive und nebenwirkungsfreie Arzneimittel zur Anhebung der EET-Konzentrationen und somit zur Milderung der anhaltenden HPV bzw. chronischen hypoxieinduzierten PH eingesetzt werden, im Einklang mit der schon seit 20 Jahren in klinischen Studien erfolgreich praktizierten Behandlung der PH durch den Einsatz ebendieser sEH-Inhibitoren.
