Aufklärung der molekularen Gundlagen der Box C/D snoRNP vermittelten enzymatischen Methylierung von RNA mittels Lösungs-, SAS und Elektronenmikroskopie

• Antragstellerin: Professorin Dr. Teresa Carlomagno
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2009 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 154387182

Im ersten Förderzeitraum haben wir die Strukturuntersuchung des Box C/D snoRNP (ribonukleoprotein) Komplexes, der für die Methylierung von neu transkribierter rRNA im Nucleolus verantwortlich ist, durch eine Kombination von Lösungs- und Festkörper-NMR Spektroskopie und Elektronenmikroskopie vorgeschlagen. In den ersten vier Jahren haben wir die Struktur des 390 kDa RNP durch eine Kombination von NMR Spektroskopie und Kleinwinkelneutronenstreuung (SANS) erhalten, durch Verwendung von Paramagnetischer Relaxationsverstärkung (NMR) und Kontrastvariation (SANS). Durch die Bindung des Substrats findet eine große Konformationsänderung statt, die eine unerwartete dreidimensionale Anordnung des katalytischen RNP aufdeckt. Wir haben die Strukturen des Enzyms in inaktiver Form ohne Substrat RNA und in aktiver Form mit Substrat RNA mit einer Genauigkeit von ~ 5 Å bestimmt. Darüber hinaus haben wir einen NMR detektierten Assay entwickelt, der eine bisher nicht beschriebene, ortsabhängige Regulation der Methylierung zeigte, mit möglichen Auswirkungen auf die rRNA Faltung. Zuletzt haben wir ein Strukturrechnungsprotokoll für große RNP Komplexe in Lösung mit großer Anwendungsbandbreite für eine Vielzahl von Systemen etabliert. Diese Ergebnisse wurden vor kurzem in Nature (doi: 10.1038/nature12581) publiziert. Die Entwicklung von großangelegten in vivo Experimenten, die die Signifikanz des von uns entdeckten regulatorischen Mechanismus zur Ribosombiogenese beleuchten könnte, erfordert geschickte Eingriffe in die zelluläre Kontrolle der Methylierungswege. Diese Aufgabe erfordert wiederum ein Verständnis der Enzymaktivität und Regulation auf molekularer Ebene. Unser Ziel in der nächsten Foerderperiode ist die Untersuchung des Mechanismus der RNA-Methylierung, der Konformationsänderung die ihm zu Grunde liegt und der Ereignisse, die diese dynamischen Änderungen auslösen. Zusätzlich wollen wir untersuchen ob die sequentielle Ordnung der Methylierungsereignisse, welche wir für eine Guide-RNA beobachtet haben, universell auf alle guide-RNAs übertragen werden kann. Unser Ziel ist letztendlich die Beschreibung allgemeiner Regeln zur Kontrolle der RNA-Methylierung.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen