Funktionelle und strukturelle Analyse von gamma-tubulin Komplexen

• Antragsteller: Dr. Stefan Pfeffer; Professor Dr. Elmar Schiebel
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2009
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 133570075

gamma-Tubulin-Komplexe (gamma-TuCs) initiieren in allen Eukaryoten die Assemblierung von Mikrotubuli (MT) aus alphabeta-Tubulin Untereinheiten. Dementsprechend beeinflussen gamma-TuCs die Struktur, Dynamik, Anzahl und Orientierung von MT innerhalb einer Zelle und sind deshalb essentiell für zentrale zelluläre Prozesse, wie Mitose und Meiose. Trotz dieser wichtigen Funktionen ist unser Verständnis der Struktur von gamma-TuCs limitiert und derzeit beschränkt auf eine kryo-elektronenmikroskopische (cryo-EM) Struktur des kleinen gamma-Tubulin Komplexes (gamma-TuSC) der Bäckerhefe im mittleren Auflösungsbereich. Die MT-Nukleation in der Bäckerhefe ist jedoch untypisch, da der ansonsten essentielle MT-Nukleationsfaktor MOZART von diesem Organismus nicht kodiert wird. Für den komplizierter aufgebauten gamma-Tubulin Ringkomplex (gamma-TuRC) höherer Eukaryoten ist die strukturelle Information limitiert auf eine cryo-EM Tomographiestudie bei niedriger Auflösung und Röntgenstrukturen der isolierten gamma-TuRC Untereinheiten gamma-Tubulin und GCP4. Um die MT-Nukleation auf struktureller Ebene zu verstehen, haben die Laboratorien von Dr. S. Pfeffer und Prof. Dr. E. Schiebel im Rahmen dieses Einzelantrags eine Kollaboration begonnen. Ziel der gemeinsamen Arbeit ist es die Strukturen von unterschiedlichen gamma-TuCs mittels cryo-EM zu bestimmen. Als Vorarbeiten zeigen wir in diesem Antrag cryo-EM Strukturen des Candida albicans gamma-TuSC bei ‚nahezu atomarer‘ Auflösung und des gamma-TuRCs von Xenopus laevis bei einer Auflösung von ~5 Å. Diese umfangreichen Vorarbeiten dienen als Vorlage für die Bestimmung von cryo-EM Strukturen: i) des C. albicans gamma-TuSCs mit den MT-Nukleationsfaktoren MOZART und Spc110, ii) des gamma-TuSC mit der MT Polymerase Stu2, iii) des X. laevis gamma-TuRC bei höherer Auflösung und letztendlich iv) des menschlichen gamma-TuRCs. Basierend auf diesen Strukturen werden wir seit langem ungeklärte Fragen im Mikrotubuli-Nukleationsfeld beantworten können. Wir werden adressieren, wie MOZART und Spc110 die Struktur des gamma-TuSCs beeinflussen und dessen Oligomerisierung zu einem Template für MT-Nukleation induzieren. Wir werden untersuchen, wie Stu2 zur Assemblierung von Ringkomplexen und zur MT Nukleation beiträgt. Wir werden unser vorläufiges Model für die molekulare Architektur des X. laevis gamma-TuRCs verfeinern und die Funktion einer langen Insertion in GCP6 sowie neu identifizierter Komponenten im Detail untersuchen. Zudem werden wir analysieren, wie das CM1 Motiv des Mikrozephalieproteins CDK5RAP2 auf struktureller Ebene den gamma-TuRC aktiviert. Basierend auf diesen strukturellen Erkenntnissen werden wir ein heterologes Expressionssystem für den menschlichen gamma-TuRC in Insektenzellen aufbauen, um ein manipulierbares System für Folgeexperimente zur Verfügung zu haben. Dieses Projekt wird entscheidend zu unserem Verständnis der Beziehung von Struktur und Funktion vieler gamma-TuCs von der Hefe bis zum Menschen beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen