Entwicklung neuer Tiermodelle zur Analyse erblicher Netzhauterkrankungen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Generierung von Mausmodellen für erbliche Netzhauterkrankungen ermöglicht die Untersuchung der Krankheitsprozesse in vivo mittels funktioneller und invasiver sowie histologischer Methoden. Da ein knockout jedoch selten die genotypische Situation beim Patienten widerspiegelt, kommt der Generierung von spezifischen knockin Mausmutanten zur Untersuchung des Pathomechanismus und des Krankheitsprozesses eine besondere Bedeutung zu. In der zweiten Förderperiode wurde die Pde6h knockout-Linie fertiggestellt und analysiert. Überraschenderweise zeigte die Pde6h knockout keinen retinalen Phänotyp in ERG, SLO und OCT. Wir stellten daraufhin mit spezifischen Antikörpern fest, dass Zapfen-Photorezeptoren der Maus im Gegensatz zum Menschen sowohl Pde6h als auch die Stäbchenvariante Pde6g exprimieren, so dass die murinen Zapfen das Fehlen von Pde6h durch Pde6g kompensieren. Auch das Einkreuzen der Pde6g-/- führte bislang nicht weiter, da der Stäbchendefekt der Pde6g -/- sehr früh die Zapfen schädigt und funktionelle Analysen der Pde6h-Deletion verhindert. Histologische Analysen der murinen Retinae sind im Gange. Bei der Cngb3R403Q knockin deutet sich eine reduzierte photopische Zapfenantwort im ERG an, deren Ausprägungsbild vom Alter und genetischen Hintergrund der Mäuse abhängt (SV129, C57Bl6/SV129-Hybrid). Besonders ausgeprägt ist der Phänotyp, wenn gleichzeitig Cnga3 nur auf einem Allel vorhanden ist. Mit Hilfe des generierten Cngb3-Antikörpers werden histologische Analysen durchgeführt. Rekombinante ES-Zellen für den lacZ-replacement knockout des Kcnv2 Gens als auch des Cngb3S435F nockins wurden erfolgreich hergestellt. Die bisherigen Injektionen ergaben allerdings keine keimbahngängigen Chimären. Die Generierung einer allelischen Serie von knockin-Mausmutanten für den Abca4-Transporter ist soweit erfolgt, dass nun mit der Transfektion des Knockin-Konstruktes in ES-Zellen begonnen werden kann. In Photorezeptoren spielt [Ca2+]i eine sehr bedeutsame Rolle u.a. in der Modulation der Phototransduktion im Außensegment und der Steuerung und Modulation der vesikulären Transmitterfreisetzung an der Synapse, aber auch bei der Auslösung bzw. Vermittlung zelltodinduzierender Signalkaskaden. Bis dato gab es nur die Option, den [Ca 2+]i –Spiegel bzw. dessen Fluktuation mittels Beladung der Zellen mit synthetischen Calciumindikatoren (e.g. FURA) zu analysieren. Diese Methode hat neben der fraglichen physiologischen Integrität durch die Beladung den Nachteil, dass alle Zellen mit dem Indikator beladen sind und somit selektive Untersuchungen an bestimmten Subpopulation (wie z.B. den Zapfen) schwerlich isoliert durchgeführt werden können. Es wurde daher ein transgenes Mausmodell entwickelt, welches einen biologischen Calciumsensor (TN-XL) unter Kontrolle des humanen Zapfenopsin-Promotors selektiv in den Zapfenphotorezeptoren exprimiert. In Kooperation mit der AG Prof. Euler und TP5 (Paquet-Durand) konnte gezeigt werden, dass der FRET-basierte Biosensor funktionell ist und damit sowohl pharmakologisch induzierte, als auch lichtinduzierte [Ca 2+]i -Fluktuationen am synaptischen Terminal nachweisbar sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2012) A Nonsense Mutation in PDE6H Causes Autosomal-Recessive Incomplete Achromatopsia. Am J Hum Genet 91: 527-532
Kohl S, Coppieters F, Meire F, Schaich S, Roosing S, Brennenstuhl C, Bolz S, van Genderen MM, Riemslag FC; the European Retinal Disease Consortium, Lukowski R, den Hollander AI, Cremers FP, De Baere E,Hoyng CB, Wissinger B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2012.07.006) - (2012) BK Channels Mediate Pathway-Specific Modulation of Visual Signals in the In Vivo Mouse Retina. J Neurosci 32:4861-4866
Tanimoto N, Sothilingam V, Euler T, Ruth P, Seeliger MW, Schubert T
(Siehe online unter https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.4654-11.2012) - (2012) Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. J Neurosci 32: 6981-6994
Wei T, Schubert T, Paquet-Durand F, Tanimoto N, Chang L, Koeppen K, Ott T, Griesbeck O, Seeliger MW, Euler T, Wissinger B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.6432-11.2012)
