Analyse der Komplexbildung und Membranassoziation der heterotetramen Adaptorproteine AP -1 und AP-2 mit Cargoproteinen HIV-1 Nef und CD4
Final Report Abstract
In diesem Forschungsvorhaben sollten die Mechanismen der Nef-vermittelten Rezeptorinternalisierung durch strukturbiologische und biochemische Studien auf molekularer Ebene untersucht werden. Die beiden heterotetrameren Adaptorproteinkomplexe AP1 und AP2 konnten rekombinant in großer Reinheit und Homogenität dargestellt werden, ebenso wie das myristoylierte oder nicht-lipidierte HIV-1 Nef Protein. Die durchgeführten Arbeiten an den HIV-1 Nef vermittelten Internalisierungskomplexes AP1/Nef/MHC-I und AP2/Nef/CD4 haben eine Kristallstrukturbestimmung der heterotrimären Komplexe bisher leider nicht ermöglicht, was auf eine zu geringe Affinität der einzelnen Untereinheiten zurückgeführt wird. Im Labor des Antragstellers wird an diesen Themen aber weiter gearbeitet. So könnte insbesondere die Fusion der zytoplasmatischen Domänen von CD4 oder MHC-I an den Kopplungsfaktor Nef ein weiterer Weg sein, um die Bindung an die Adaptorproteinkomplexe AP1 oder AP2 zu bewerkstelligen. Es konnte jedoch eine Kristallstruktur von HIV-1SF2 Nef im Komplex mit einer SH3-Domäne erstellt werden, in der erstmals die gesamte flexible Schleife von Nef aufgelöst war, die das für die Rekrutierung der AP-Komplexe wichtige Dileuzinmotiv beinhaltet. Die Schleifen zweier Nef-Proteine binden in dieser Struktur wechselseitig in die hydrophobe Tasche des jeweils anderen Nef-Moleküls. Somit zeigt diese Struktur potentiell eine in trans-autoinhibierte Konformation des Nef-Proteins. Die hydrophobe Tasche von Nef ist für die Erkennung von Signalmotiven in Membranrezeptoren verantwortlich, wie zum Beispiel für das Dileuzinmotiv in CD4. Außerdem konnte in der Kristallstruktur die strukturelle Basis für die mehr als 30-fach erhöhte Affinität der modifizierten SH3 Domäne zu Nef gegenüber der wildtyp Hck-SH3 Domäne geklärt werden. Die SH3 Domäne stammte aus der humanen Kinase Hck, die durch fünf Mutationen in der RT-Schleife für die Bindung an HIV-1 Nef optimiert wurde. Neben diesem Hauptprojekt wurden Teilarbeiten zur Interaktion des Tumor-Nekrosisfaktors TRAF2 mit Nef und zur Internalisierung der T Zell Rezeptoren CD3 und CD28 mit HIV-2 und SIV Nef durchgeführt. Damit konnte ein Beitrag zum Verständnis der molekularen Grundlagen der HIV-1 Nef vermittelten Internalisierung von T Zell Oberflächenrezeptoren geleistet werden.
Publications
- (2011). Conformation of the dileucine-based sorting motif in HIV-1 Nef revealed by intermolecular domain assembly. Traffic 12, 867–877
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(See online at https://doi.org/10.1128/JVI.06856-11)
