Rasterelektronenmikroskop mit FIB
Final Report Abstract
Das Gerät wurde für 3 verschiedene ultrastrukturelle Techniken eingesetzt. A. Hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie: Fragestellungen: Ultrastrukturelle Untersuchungen von Chromosomen, Immunomarkierung von Histonen mit Fluoronanogold und anschließender Silberverstärkung. Spezifische Markierung von DNA mit metallorganischen Verbindungen zur Detektion über BSE. Hochauflösende Untersuchungen an Mikroorganismen zur Darstellung aller strukturell erfassbarer Parameter (Flagellen, Pili, Fimbrien, S-Layer etc). B. Kryorasterelektronenmikroskopie: Untersuchung einer Vielzahl biologischer Proben nach Hochdruckkryofixierung, Gefrierbruch und Untersuchung im SEM, frozen-hydrated. Besonders erfolgreich waren die Untersuchungen von Mikroorganismen, insbesondere Magnetbakterien. Hier konnten die Magnetosomen mit ihren Membranen und den Axialfilamenten in situ dargestellt werden. Die Elementanalyse mit Hilfe der zwei 30 mm2 Detektoren ist empfindlich genug, um in kurzer Zeit (wenige Minuten) ein Elementmapping an gefrorenen Proben durzuführen. So konnten nicht nur die Magnetosomen über die Elemente Eisen und Sauerstoff, sondern auch die Speicherstoffe (Schwefel und Poly-ßhydroxybuttersäure) unterschieden werden. C. 3D-Rekonstruktion mit FIB-FESEM: Der Großteil der Untersuchungen erfolgte an eingebetten Proben mit FIB-FESEM zur Rekonstruktion histologischer und zellulärer Strukturen. Das Spektrum war breit gefächert: • 3D-Rekonstruktion der Netzhaut von Fischen. • 3D-Rekonstruktion von Glomeruli/Podozyten der Niere. • 3D-Darstellung von Wurzelzellen mit defekter Zellwandbildung. • Abbau der Lipidbodies und Entstehung der Glyoxysomen in Keimblättern von Arabidopsis. • 3D-Rekonstruktion der Dictyosomen der Alge Micrasterias. • 3D-Rekonstruktion von Archaea zur Darstellung zellulärer Kontakte über fibrilläre Strukturen. • Hochauflösender Vergleich von FIB-FESEM und TEM-Tomographie. Strukturelle Analyse der Verteilung von Immunomarkern unterschiedlicher Histon-Varianten bei Chromosomen verschiedener Pflanzen- und Tierarten mit zwei unterschiedlichen Ansätzen: a. Chromsomen auf Glasobjektträgern wurden nach Kohlebedampfung direkt geschnitten um die Verteilung interner Hohlräume sowie Immunomarker darzustellen. b. Chromosmen auf Glasobjektträgern wurden in dünne Schichten Kunstharz (entweder wasserlösliche oder nach Entwässerung in Epoxide) eingebettet und dann geschnitten. Hohlräume sind dann nach Markierung mit DNA-spezifischen Schwermetall-Verbindungen indirekt darstellbar. Allerdings können die Immunomarker höher aufgelöst dargestellt werden.
Publications
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