Stabilität und Funktion von Proteinen in nanostrukturierten Umgebungen
Biochemistry
Biophysics
Final Report Abstract
Im Rahmen dieses Projekts wurden Struktur, Dynamik und Funktion von Proteinen insbesondere in nanostrukturierten Umgebungen untersucht. Dazu wurden die Proteine auf planaren Glasoberflächen spezifisch immobilisiert, die mit PEG funktionalisiert waren. Es wurden auch Oberflächen evaluiert, die mit perfluoroalkyl-Polymeren beschichtet waren. Hierbei kamen entsprechende perfluoroalkyl-Linker zum Einsatz, mit denen die Proteine durch Fluor-Fluor-Wechselwirkungen an die Oberflächen gebunden wurden. Als weitere Nanostruktur wurden DNA-Origamis entwickelt und evaluiert, die sich mit Hilfe kurzer DNA-Stränge reversibel zwischen zwei Konformationen hin und her schalten lassen, welche sich in ihrer Geometrie deutlich unterscheiden. Proteine können daran spezifisch gebunden werden, so dass sich diese Plattformen hervorragend eignen sollten, um biomolekulare Reaktionen bei kontrollierter Abstandsänderung durchzuführen. Fluoreszenzbasierte Techniken mit Einzelmolekülempfindlichkeit standen als spektroskopische bzw. mikroskopische Analysenmethoden im Vordergrund. Ein kommerzielles konfokales Mikroskop (Picoquant, MT200) mit gepulster Anregung für Multiparameteranalysen wurde in Betrieb genommen sowie ein Weitfeldmikroskop mit Prismen-TIRF-Anregung aus Komponenten aufgebaut; spezielle Auswerteroutinen (einschließlich Hidden-Markov-Modeling) wurden etabliert und weiter verfeinert. Die Faltung des kleinen Modellproteins RNase H wurde mit Einzelmolekül-FRET-Experimenten analysiert. Dazu wurde das Protein an ausgewählten Positionen in der Polypeptidkette gentechnisch mit Cysteinen modifiziert, um an die Thiolfunktionen ein Donor-Akzeptor-FRET- Paar von Fluoreszenzfarbstoffen zu binden. Die Energielandschaft des Proteins enthält neben dem ungefalteten (U) und gefalteten (F) Zustand noch ein Faltungsintermediat (I), das in früheren FRET-Messungen nicht identifiziert werden konnte. FRET-Experimente, die unter Variation der GdmCl-Konzentration bei pH 3 und 7.2 mit hoher Statistik durchgeführt wurden, konnten eindeutig das Vorhandensein eines Faltungsintermediats nachweisen; die Zeitkonstante der Interkonversion zwischen den U und I Zuständen im Gleichgewicht wurde aus den Fluoreszenzfluktuationen an immobilisierten Präparationen zu ~1 ms bestimmt. Fluoreszente Protein der GFP-Familie wurden spektroskopisch und strukturell untersucht und durch Einbringen von Mutationen für die Anwendung als Markerproteine in der höchstauflösenden, auf Einzelmoleküldetektion basierenden Fluoreszenzlokalisationsbildgebung optimiert. Eine monomere Variante des Proteins IrisFP wurde entwickelt, die zwei verschiedene Photoaktivierungsmodi kombiniert. Dadurch ermöglicht dieses Protein pulse-chase imaging Experimente mit Höchstauflösung. Das reversible Photoschalten, das bei einer Reihe von photoaktivierbaren FPs gefunden wurde, wurde am Beispiel von mIrisGFP im Detail untersucht. Ein Mechanismus des lichtinduzierten Prozesses wurde erarbeitet, bei dem die Photoisomerisierung des GFP-Chromophors strikt an seine Protonierung gekoppelt ist.
Publications
- (2010) A photoactivatable marker protein for pulse-chase imaging with superresolution. Nat. Methods 7, 627 – 630
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