Structural dynamics and regulation of the Sec61 complex
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Projekt hatte den humanen Sec61-Komplex als zentrales Thema, wobei es vor allem um seine Dynamik sowie seine regulatorischen Komponenten und Mechanismen ging. Der Sec61-Komplex ist ein heterotrimeres Protein der Membran des endplasmatischen Retikulums (ER) und bildet in seiner offenen Form einen wässrigen Kanal für den Membraneintritt bzw. -durchtritt von naszierenden und auch neu-synthetisierten Vorläuferpolypeptiden. Da der offene Kanal auch für Ca2+ permeabel ist und das ER humaner Zellen auch den Hauptspeicher für Ca2+ in den Zellen darstellt, muss das Öffnen und Schließen des Kanals, das so genannte Gating streng kontrolliert werden. In unserer früheren Kooperation hatten wir den aus Hundepankreas gereinigten und rekosntitiuerten Sec61 Komplex in Einzelkanalmessungen als dynamischen Kanal charakterisiert, der durch Vorstufenproteine auch für Ionen geöffnet werden kann. Im vorliegernden Projekt konnten wir zeigen, dass dieses dynamische Verhalten für die Proteintransportaktivität des Komplexes essentiell ist. Darüber hinaus wurden in derselben Art von Messungen das Hsp70-Chaperon des ER-Lumens BiP und das cytosolische Protein Calmodulin als allosterische Regulatoren des Sec61-Kanals charakterisiert, die den Kanal schließen können. Dies führte uns zu der Hypothese, dass das Binden von BiP an den Sec61-Komplex am Ende eines Proteintranslokationsvorgangs den Austritt von Ca2+ verhindert und dass im Fall des Austritts von Ca2+ deren Bindung an Calmodulin das Protein an den Sec61-Komplex rekrutiert und diese Bindung den Austritt von Ca2+ endgültig verhindert. Diese Befunde konnten in der Echtzeitmessung von cytosolischem Ca2+ in lebenden humanen Zellen bestätigt und um die Erkenntnis erweitert werden, dass an der Aktivität von Ca2+-Calmodulin auch das ER-Membranprotein Sec62 beteiligt ist. In diesen Untersuchungen sowie auch in biochemischen und biophysikalischen Proteininteraktionsstudien wurden der ER-luminale Loop 7 des Sec61α als Bindungsstelle von BiP und ein IQ-Motif am cytosolischen Aminoterminus von Sec61α als Bingugstelle von Ca2+-Calmodulin charakterisiert. Diese Befunde wurden auch in unterschiedlichen bioinformatischen Ansätzen bestätigt und erlaubten uns schließlich ein atomares Arbeitsmodell für das Gating des Sec61-Komplexes durch seine drei allosterischen Regulatoren vorzuschlagen. Darüber hinaus haben wir diese Vorstellungen auch zur Grundlage einer Hypothese gemacht, nach der die Ca2+-Permeablität des humanen Sec61-Komplexes unter andauerndem ER-Stress am Umschalten der Zelle von der ER-Stressantwort zur Apoptose beteiligt ist. Danach führt das dauerhafte Rekrutieren von BiP an fehlgefaltete Polypeptide im ER dazu, dass BiP nicht mehr seiner Funktion beim Verschließen des Sec61-Kanals nachgehen kann und es zu massivem Ca2+-Austritt aus dem ER kommt, der zur Aktivierung der Apoptose beiträgt. Dieses Konzept wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass ein mutiertes Se61α, das nicht mehr von BiP gebunden und reguliert werden kann zur Apoptose von pankreatischen ß-Zellen und zu Diabetes in der Maus führt. Wir haben für diese Art von Erkrankungen daher die Bezeichnung „Sec61-Channelopathies“ geprägt. In Bezug auf die Proteintransportaktivität des Sec61-Komplexes konnten wir zeigen, dass sie durch die Bindung von Ca2+-Calmodulin nicht beinträchtigt wird und dass die Bindung von BiP auch das Öffnen des Sec61-Komplexes unterstützt werden kann, sofern ein Vorstufenprotein an den Kanal gebunden ist. Diese Unterstützung durch BiP wird offenbar nur von machen Vorstufenproteinen benötigt, was möglicherweise mit den Eigenschaften des Signalpeptids zusammen hängt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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