LC/ESI-MS/MS-Massenspektrometer mit linearer und elektrostatischer Ionenfalle
Final Report Abstract
Das LTQ-Orbitrap XL-Massenspektrometer wird seit seiner Inbetriebnahme am 01.05.2008 in folgenden Forschungsprojekten der AG Sinz eingesetzt (siehe auch http://agsinz.pharmazie.uni-halle.de). Untersuchung der Interaktion zwischen Calmodulin und Munc13: Die synaptische Transmission zwischen Neuronen kann an die neuronale Netzwerkaktivität angepasst werden. Dieses Phänomen wird als Kurzzeitplastizität (Short-Term Pasticity; STP) bezeichnet und Munc13-Proteine sind die Hauptregulatoren der STP. Jedoch sind die molekularen Mechanismen sowie die Identität der Calcium-Sensor- und -Effektor- Komplexe weitgehend unbekannt. Eine konservierte Calmodulin-Bindungsgregion wurde in UNC- 13/Munc13-Proteinen identifiziert. Chemische Cross-Linking-Experimente werden zwischen Calmodulin und von Munc13 abgeleiteten Peptide mit amin- und photo-reaktiven Cross-Linkern durchgeführt. Nach der Cross-Linking-Reaktion werden die vernetzten Komplexe mit Proteasen gespalten und die Peptidmischungen werden mittels Nano-HPLC/Nano-ESI-Orbitrap-MS/MS untersucht. Die Vernetzungsprodukte geben Distanzbeschränkungen und erlauben somit die Erstellung von Modellen für die Calmodulin/Munc13-Peptid-Komplexe. Neue CID-spaltbare Cross-Linker: Synthese, Fragmentierungsmechanismen und Anwendung zur Proteinstrukturanalyse: In diesem Projekt sollen neue Cross-Linking-Reagenzien entwickelt, synthetisiert und umfassend getestet werden. Die neuen Reagenzien fragmentieren aufgrund ihrer Struktur bei Kollisionsaktivierung (Collision-Induced Dissociation, CID) in Tandem-MS-Experimenten kontrolliert und vorhersehbar und erlauben so eine selektive und hochempfindliche Identifizierung von entsprechend derivatisierten Peptiden. Die neuen Cross-Linking-Reagenzien sollen die Proteinanalyse an allen etablierten Tandem-MS Instrumenten, d.h. unter Stoßaktivierung bei entweder geringer Stoßenergie (lineare Ionenfalle LTQ) bzw. höherer Stoßenergie (TOF/TOF) gewährleisten und die Anwendung der Ionisiationsmethoden ESI und MALDI erlauben. Die neuen Reagenzien werden für Interaktionsstudien zwischen der Photorezeptor-Guanylatcyclase und ihrem Bindungsprotein, dem Guanylatcyclase-aktivierenden Protein 2 (GCAP-2), zwischen Calmodulin und Munc13-Proteinen sowie zwischen Laminin und Nidogen eingesetzt. Studium der Laminin-Nidogen-Interaktion: Ziel dieses Projektes ist die Etablierung von Verfahren, die eine Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen in-vitro und in-vivo durch eine Kombination von chemischer Quervernetzung, proteolytischer Spaltung und massenspektrometrischer Identifizierung benachbarter Proteinregionen erlauben. Die Interaktion zwischen den Basalmembranproteinen Laminin und Nidogen dient zur Etablierung der Technologie. Mit den in diesem Projekt entwickelten Methoden wird ein „Tool“ für in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen von Proteinwechselwirkungen zur Verfügung stehen. 1. Charakterisierung der Bindungsregionen zwischen Nidogen-1 bzw. Nidogen-2 und Lamininkonstrukten (N-terminale Region des Laminin γ1 mittels in-vitro-Quervernetzung durch amin-reaktive, isotopenmarkierte und trifunktionelle (biotinylierte) Reagenzien). Anschließend erfolgen eine proteolytische Spaltung der Proteinkomplexe und eine massenspektrometrische Charakterisierung der gebildeten Quervernetzungsprodukte. 2. Analyse der in-vivo-Interaktionen in Zellkultur mit Laminin γ /Nidogen-1 bzw. Nidogen-2 überexprimierenden Zelllinien mittels photoaktivierter Quervernetzung von Laminin γ1 und Nidogen-1 bzw. Nidogen-2, in die die unnatürlichen, photoaktivierbaren Aminosäuren Photo-Leucin und/oder Photo- Methionin während der Biosynthese inkorporiert wurden. 3. Mit Hilfe des in-vivo-Cross-Linking-Ansatzes sollen neue Laminin/Nidogen-Liganden identifiziert werden. Zusätzlich zu in-vivo-Experimenten mit photo-aktivierbaren Aminosäuren werden Cross-Linking- Experimente in der Zelle mit Formaldehyd durchgeführt. Entwicklung eines 3D-LC/MS-System für die Proteinanalyse: Es wird ein integriertes 3D-Nano-HPLC/MSSystem entwickelt, das einen Enzymreaktor, eine nachfolgende Trennung der Spaltpeptide und die massenspektrometrische Analyse vereint. Ein monolithischer Trypsinreaktor wird in ein bestehendes Nano- HPLC/Nano-ESI-LTQ-Orbitrap-MS-System integriert, was wesentliche Vorteile für die effiziente und schnelle Analyse von Proteinen bietet. Neue Ansätze zur gezielten Therapie nichtkleinzelliger Bronchialkarzinome: Mittels SILAC (Stable Isotope Labeling Using Amino Acids in Cell Culture)-Analyse werden Sekretomanalysen von nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomzellen durchgeführt und mit den Sekretommustern gesunder Zellen verglichen. Für diese Analysen ist eine hochauflösende massenspektrometrische Methode (Nano-ESI-LTQ-Orbitrap-MS) unverzichtbar. Darüber hinaus werden folgende Projekte unter Verwendung einer Kombination aus chemischem Cross- Linking und Nano-HPLC/Nano-ESI-LTQ-Orbitrap-MS/MS durchgeführt: Konformationsstudien des Peroxisom Proliferator-aktivierten Rezeptors alpha (PPARα) nach Ligandenbindung und Interaktionsstudien zwischen der Formiatdehydrogenase und ihren Bindungsproteinen.
Publications
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