Aktivitätskontrolle von autonomen bakteriellen AAA+ Disaggregasen

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Axel Mogk
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 556583451

Die hexameren AAA+ Proteine ClpG und ClpL fungieren als potente Disaggregasen und vermitteln extreme Hitzeresistenz in Bakterien. ClpG und ClpL schützen pathogene Bakterien gegen hitzebasierte Sterilisationsmethoden und stellen somit wichtige Persistenzfaktoren und mögliche Antibiotikaziele dar. Die Bestimmung ihrer regulatorischen Mechanismen wird wichtige Informationen für zukünftige Antibiotikaentwicklungen liefern. ClpG und ClpL arbeiten autonom, im Gegensatz zu bis dato characterisierten AAA+ Disaggregasen (z.B. ClpB), welche Partnerproteine zur Aktivierung benötigen. Sie stellen daher höchst geeignete Modellsysteme zur Untersuchung der Aktivitätskontrolle von partner-unabhängigen AAA+ Proteinen dar. Wie wird die Aktivität der Disaggregasen in Abwesenheit von Substrat reprimiert und wie führt Substratbindung zu deren Aktivierung? Unsere unveröffentlichen Arbeiten identifzieren verschiedene Ebenen der Aktivitätskontrolle. Die Regulation der ClpG and ClpL Aktivität beinhaltet die Ausbildung alternativer Assemblierungszustände, welche interagierende AAA+ Hexamere und große AAA+ Spiralen beinhalten. Weiterhin erfolgt eine Kontrolle der ATPase Aktivität in isolierten Hexameren. Alle Ebenen der Aktivitätskontrolle werden durch Substratinteraktion reguliert und schliessen substrat-bindende N-terminale Domänen und weitere Extradomänen wie die „coiled-coil“ M-Domäne ein. Wir wollen die einzelnen Schritte der substrat-induzierten Aktivierung von autonomen Disaggregasen bestimmen und untersuchen wie die verschiedenen Regulationsebenen miteinander verzahnt sind. Wir beabsichtigen: (1) die Umwandlung von inaktiven ClpG Spiralen in aktive Assemblierungszustände durch Substratbindung zu untersuchen. Substrat-induzierte Strukturänderungen werden durch cryo EM und komplementäre XL-MS Experimente (Quervernetzungsexperimente gekoppelt mit massenspektrometrischer Analyse) bestimmt. Die N1 und N2 Domänen von ClpG sind in Substratbindung involviert. Ihre regulatorische Funktionen werden durch eine umfangreiche Mutagenese basierend auf Struktur- und Quervernetzungsdaten analysiert. (2) eine konstitutiv hexamere ClpG Variante zu nutzen um selektiv den Einfluß von Substrat auf ATPase Aktivierung zu bestimmen. Dies ermöglicht uns die einzelnen Ebenen der Aktivitätskontrolle separat zu analysieren. (3) die regulatorischen Rollen der “coiled-coil” M-Domäne und des ungefalteten C-terminalen Anhangs zu bestimmen. Beide Domänen üben entgegengesetzte Effekte auf die Bildung von inaktiven ClpG Spiralen aus und wir werden analysieren wir ihre Funktionen miteinander verflochten sind. (4) die Dynamik von inaktiven ClpL und ClpG Komplexen mit Hilfe eines abstandsabhängigen Fluoreszenzassays zu bestimmen. Dieser Assay beobachtet die Interaktionen von M-Domänen, welche für die Ausbildung der inaktiven Assemblierungzustände entscheidend sind. Wir werden untersuchen, wie Substratbindung und regulatorische Domänen die Assoziations- und Dissoziationskinetik der Komplexe modulieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen