Funktionelle Charakterisierung von Centrinen und deren Wechselwirkungen mit heterotrimeren G-Proteinen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In der abgelaufenen Förderungsperiode des Projektes konnten wir wertvolle neue Erkenntnisse zur Interaktion der Centrine mit dem visuellen G-Protein Transduin (G1) sammeln. Mit Hilfe von FRET-Analysen zeigten wir erstmals, dass die zunächst in vitro beschriebene Assemblierung der Centrin-G-Protein-Komplexe auch in der Zelle ausgebildet werden. Auch gelang es uns in den N-termini der beiden Gtß- und Gty-Untereinheiten ein neues Proteinbindemotiv zu identifizieren. Dieses zeichnet sich durch eine sehr hohe Sequenzhomologie zwischen den beiden Untereinheiten aus. Centrin1 bindet an dieses Motiv als Dimer, wobei die Centrin-C-termini mit N-termini der Gtß- und Gty-Untereinheiten die hydrophoben Wechselwirkungen eingehen dürften. Die homomere Interaktion der Centrin-Moleküle beruht im Dimer auf den sechs Aminosäuren L25TEDQK30, die zwischen EF3- und EF4-Handmotiven in der C-terminalen Hälfte angesiedelt sind. In retinalen Photorezeptorzellen konnten wir eine lichtabhängige Phosphoryliemng von Centrinen feststellen. In vitro-Assays zeigten, dass die CK2 in den Centrinen Cen1, Cen2 und Cen4 selektiv jeweils ein Threonin, das zwischen den EF-Hands EF3 und EF4 der Centrine lokalisiert ist, phosphoryliert. Bei Cen3 fehlt dort eine mögliche CK2-Phosphoryliemngs-Site und wird, wenn überhaupt, nur im sehr geringen Maße durch die CK2 phosphoryliert. KLS-Untersuchungen zeigten weiter, dass durch diese Phosphorylierung die Ca2+-Affinität der EF-Hands EF3 und EF4 vermindert wird, was eine Reduktion in der Affinität der Centrine zu Gt zu Folge hat. Weiterführende Untersuchungen zu Centrinen und der CK2 sowie deren Wechselwirkungen zeigten eine Kolokalisation beider Proteine im Verbindungscilium der Photorezeptorzelle und eine gemeinsame parallele direkte Bindung an Mikrotubuli, die das zentrale Cytoskelett des Photorezeptorciliums aufbauen. Des Weiteren identifizierten wir die PP2C als die Phosphatase, die die CK2-Phosphorylierung der Centrine wieder dephosphoryliert. Demnach spricht vieles dafür, dass das Zusammenspiel der Kinase (CK2) und der Phosphatase (PP2C) die Interaktion zwischen den Centrinen und Gt lichtabhängig moduliert und damit möglicherweise insgesamt die Gt- Translokation reguliert. Welche der drei in Frage kommenden Centrine wirklich für die Regulation der Gt-Translokation essentiell sind konnten wir in unseren knock-out-, knock-down- und Überexpressionsansätzen in der Förderungsperiode des Projektes leider nicht abschließend klären. Allerdings konnten wir uns wertvolle Tools und Voraussetzungen erarbeiten, die es ermöglichen sollten, dass wir in naher Zukunft auch hier einen größeren Schritt vorankommen.
