Molekularer Mechanismus des G-Actin-Schalters bei der Regulation der Transkription
Final Report Abstract
Monomeres G-Actin reguliert direkt die Rho-induzierte Transkription von SRF- Zielgenen. Dies verläuft über den SRF-spezifischen Ko-Aktivator MAL/MKL/MRTF, der durch direkte Interaktion mit G-Actin reguliert wird. Bislang unverstandene Ereignisse im Actin:MAL-Komplex führen zu seiner Dissoziation und zur Aktivierung von MAL. Wir wollten diesen "Actin-Switch" durch Charakterisierung bereits identifizierter Actin-Punktmutanten und Ihrer MAL-Komplexe untersuchen. Für die biochemische Analyse wurden dazu die Actin-Mutanten in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert und über N-terminale His- und StrepII-Tags aufgereinigt. Es gelang zwar, die Expression durch Fermentation im Bioreaktor zu optimieren und die säulenchromatographische Aufreinigung durch FPLC zu etablieren. Auch waren die erhaltenen Actin-Proteine im Hinblick auf Polymerisationsverhalten und MAL- Komplexbildung funktionell. Als ungelöstes Problem stellte sich jedoch die geringe Konzentration der aufgereinigten Actin-Mutanten heraus; diverse Aufkonzentrierungs-Ansätze scheiterten, vermutlich aufgrund lokaler Polymerisation und Verlust an Filtrationsmembranen. Dadurch war eine detaillierte biochemische Charakterisierung der Actin-Mutanten und ihrer MAL-Komplex unmöglich. Um den Actin:MAL-Komplex dennoch besser zu verstehen wurde alpha-Actin aus Kaninchenmuskel aufgereinigt sowie verschiedene N-terminale MAL-Fragmente, die die Actin-bindenden RPEL-Motive enthalten, rekombinant hergestellt. Zum einen konnte hiermit der Actin:MAL-Komplex im nativen Gel erfolgreich rekonstituiert werden. Zum anderen wurden polyklonale und monoklonale Antikörper gegen die rekombinanten MAL-Fragmente und MAL-Peptide hergestellt und detailliert charakterisiert. Diese stellten sich als instrumental für Immunfluoreszenzdetektion und Chromatin-Immunpräzipitation in weiteren Projekten heraus. Obwohl potentiell modulatorische Actin-Bindeproteine im Actin:MAL-Komplex nicht nachgewiesen werden konnten, besteht die Möglichkeit, das ABPs den Komplex auflösen. Daher werden sich künftige Projekte mit der Rolle von Thymosin beta4 und WH2 Domänen beschäftigen; diese kompetieren wahrscheinlich direkt mit MAL um die hydrophobe Tasche des Actins, wie die kürzlich publizierte Struktur des MAL:Actin-Komplexes vermuten lässt.
Publications
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