De novo metabolic engineering of a designed biosynthetic pathway for complex terpenoids in yeast
Final Report Abstract
Der diterpenoide Naturstoff Taxol (Paclitaxel) wird heute für die Behandlung einer Reihe von Krebserkrankungen eingesetzte. Die Bereitstellung von Taxol, wie auch die seines chemischen Derivats Taxotere (Docetaxel), welches ebenfalls für die Behandlung von Krebserkrankungen verwendet wird, beruht heute ausschließlich auf der Extraktion von Eiben Pflanzenzellmaterial. Die Biosynthese der Taxane (von Taxol und weitere taxoide Naturstoffen) ist nur für die Familie der Taxaceae und für einige oft mit Taxus sp. assoziierten Endophyten bekannt. Die Gewinnung von Taxol und weiteren Taxane für die semisynthetische Herstellung von Taxol und Taxotere aus Taxus erweist sich jedoch als aufwendig, zum einen durch das langsame Wachstum der Eibe, zum anderen durch die Biosynthese einer Vielzahl chemisch sehr ähnlicher, aber pharmakologisch wertloser Taxane. Auf der Suche nach alternativen Quellen für Taxol wurden mittlerweile einige chemische Totalsynthesen beschrieben, welche sich aber für einen kommerzielle Produktion als zu aufwendig darstellen. Die Biosynthese von Taxol in der Eibe ist heute in vielen Bereichen gut aufgeklärt. Viele der in der Biosynthese beteiligten Gene konnten isoliert und funktionelle zugeordnet werden. Das Metabolic Engineering eines leicht zu kultivierenden, gut untersuchten Mikroorganismus wie z. B. der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) wäre somit eine attraktive Möglichkeit zur Bereitstellung von Taxanen wie auch anderen terpenoiden Naturstoffen und stellt heute ein aktives Wissenschaftsgebiet dar. Im geförderten Vorhaben konnte durch das Metabolic Engineering von Saccharomyces cerevisiae der Grundstein für die Untersuchung der Etablierung eines effizienten Biosynthese einen diterpenoiden Naturstoffs gelegt werden. Durch gezielte metabolische Eingriffe konnte ein Hefestamm mit der Befähigung der Biosynthese von Taxa-4(5),11(12)-dien (Taxadien), dem ersten, zentralen Biosynthesewegszwischenprodukt erhalten werden. Aufbauend auf diesen Taxadien biosynthetisierenden Stamm wurden zusätzliche bekannte Gene der Taxol- Biosynthese (die Taxadien-5?-hydroxylase und die Taxan-10?-hydroxylase) eingebracht, eine Beurteilung der erhaltenen Taxane steht im Moment jedoch hier noch aus. Parallel zu den Arbeiten am Metabolic Engineering des Taxol Biosynthesewegs in Hefe wurden Arbeiten zur bioorganischen Synthese von Taxadien unternommen. Die Zyklisierung von Geranylgeranyldiphosphat zu Taxadien stellt den ersten, zentralen Biosynthesewegsbestimmenden Schritt für die Biosynthese der Taxane dar. Bis heute gelang es jedoch nicht Taxadien in nennenswerten Mengen aus Taxus Zellmaterial zu isolieren. Einen chemische Synthese von Taxadien ist in der Literatur beschreiben, aber gestaltet sich bedingt durch eine Vielzahl von Syntheseschritten und einer geringen Ausbeute als nicht attraktiv. Im Vorhaben wurde deshalb die bioorganische Synthese von Taxadien mittels der Taxadiensynthase verfolgt. Hier konnte bedeutende Fortschritte im Verständnis der heterologen Expression der pflanzlichen Terpencyclase erhalten werden und mit Hilfe der Expression in Pichia pastoris ein effizientes System für die Bereitstellung von Taxadiensynthase für Biokatalyseanwendungen etabliert werden. In den Experimenten zur bioorganischen Synthese von Taxa-4(5),11(12)-dien konnte ebenfalls gezeigt werden, dass eine Immobilisierung des Enzyms (an Seprabeads) möglich ist und dies zu einer wesentlichen Stabilitätsverbesserung des Proteins beiträgt.
Publications
- (2008) Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paciltaxel) production. Metab. Eng. 10, 201-206
Engels, B., Dahm, P. & Jennewein, S.
- (2009) Taxol: a complex diterpenoid natural product with an evolutionarily obscure origin. African J. Biotechnol. 8, 1370- 1385
Heinig, U. & Jennewein, S.
