Proteasome molecular composition, biosynthesis, turnover and function during viral infection
Final Report Abstract
Die proteolytische Aktivität des Proteasoms kann durch den Austausch der drei aktiven Untereinheiten ßl, ß2 und ß5 moduliert werden. Im gesunden Organismus liegt typischerweise das konstitutive Proteasom vor, bei dem nach Infektion die konstitutiven gegen induzierbare Untereinheiten ausgetauscht werden (Immim - Proteasom). Im Rahmen dieses Projektes wurden effiziente molekulare Methoden der Massenspektrometrie entwickelt, um in vitro proteasomale Abbaupeptide strukturell zu charakterisieren und zu quantifizieren. Zur qunatitativen Bestimmung erwies sich die direkte Peptid/Protein-Massenspektrometrie nur bedingt geeignet, während mittels LC-MS/MS eine effiziente Quantifizierung mittels Einzelionenchromatogramme zur Quantifizierung herangezogen wurde. Mit Hilfe dieser Methode wurde der Proteasom-Abbau von immunologisch relavanten Peptiden, die jeweils T-Zellepitope enthalten, qualitativ und quantitativ verfolgt. Im Mausmodell ist die cytotoxische T-Zellantwort unter anderem gegen ein Epitop aus den Aminosäuren 33-41 des Glycoproteins GP gerichtet, während das Epitop GP(276-286) nur untergeordnet auftritt. Das Peptid GP(271- 295) wurde synthetisiert, in vitro mit konstitutivem und Immun-Proteasom abgebaut und die proteolytischen Produkte mittels LC-MS identifiziert und quantifiziert. Durch Vergleich von konstitutivem und Immun-Proteasom konnte gezeigt werden, dass die Peptide GP(275-291) und GP(281-289) bevorzugt durch das Immunproteasom gebildet werden, während die Konzentration der beiden Epitop-Peptide GP(275-286) und GP(276-286) im Vergleich zum Abbau durch das konstimtutive Proteasom etwa zweifach verringert wird. Das von den T-Zellen nur untergeordnet erkannte Epitop GP(275-286) wird vom Immunproteasom weiter zu kürzeren Peptiden ohne antigene Eigenschaften abgebaut. Ebenfalls mittels LC-MS wurden die proteolytischen Peptide untersucht und quantifiziert, die aus dem Proteasom-Abbaut eines Peptids entstanden sind, welches das Epitop des männlichen Transplantationsantigens UTY-W246-I254 enthält. Ein synthetisches Peptid, das auf beiden Seilen des Epitops noch jeweils acht flankierende Aminosäuren enthält, wurde mit dem Wildtyp- im Vergleich zum ßli-knockout-Immunproteasom abgebaut; das Epitop wird in beiden Fällen vom Proteasom gespalten. Das Wildtyp-Immunproteasom spaltet bevorzugt Peptidbindungen N-terminal von Asp und His; diese Aktivität wird durch den LMP2-knockout etwa 2-3-fach reduzien. Im Gegensatz hierzu spaltet das knockout-Immunproteasom bevorzugt N-terminale Bindungen von Asn, Gin und Leu. Das 20S Proteasom der Maus wurde isoliert, mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und die einzelnen Untereinheiten nach proteolytischem Abbau vollständig durch hochauflösende massenspektrometrische Proteomanalyse charakterisert.
Publications
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