Extraktion von Nukleinsäuren mit inversmizellaren Zweiphasensystemen
Final Report Abstract
Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst der Einfluss verschiedener Salze und Salzkonzentrationen auf das Extraktionsystem bestehend aus TOMAC, iso-Octan und Wasser untersucht. Neben dem Salz hat die Venwendung unterschiedlicher Alkohole und Alkoholkonzentrafionen im Extraktionssystem einen wesentlichen Einfluss. Mit steigender Alkoholkonzentration verschiebt sich der Extraktionspunkt bei der Hinextraktion zu geringeren lonenstärken. Dies deutet auf eine Verringerung der Mizellgröße mit steigender Alkoholkonzentration hin. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte RNA mittels eines zweistufigen Extraktionsprozesses bestehend aus einer Hinextraktion in die inversmizellare Phase und Rückextraktion in eine neue wässrige Phase aus einem diafiltrierten bakteriellen Klarlysat entfernt werden, während eine vollständige Wiederfindung der Plasmid- DNA erzielt werden konnte. Ferner wurde die Abreicherung anderer Verunreinigungen durch die inversmizellare Extraktion betrachtet. Proteine und chr. DNA konnten effektiv entfernt werden, während Endotoxine durch geschickte Prozessintegration ausreichen abgereichert werden konnten. Die inversmizellare Extraktion mit einem TOMAC/iso-Octan-System ermöglicht somit eine effiziente und gut skalierbare Aufarbeitung von Plasmid-DNA aus bakteriellem Klarlysat. Im Vergleich zu anderen Extraktionssystemen ist das inversmizellare Zweiphasensystem im Hinblick auf die Einhaltung der Qualitätskriterien mindestens gleich effizient oder überlegen. Ein weiterer Vorteil beispielsweise gegenüber chromatographischen Verfahren liegt in der kurzen Prozesszeit. Für eine vollständige Verteilung der Biomoleküle im Extraktionssystem sind nur wenige Minuten erforderlich. Zusätzlich bietet der Prozess die Möglichkeit einer starken Ankonzentrierung des Produkts. Weitere Untersuchungen bezüglich der strukturellen Eigenschaften inverser Mizellen und Parametern, die diese Strukturen im Rahmen des Extraktionsprozesses beeinflussen sind von besonderem Interesse. Eine genaue Betrachtung des Verteilungsverhaltens von Biomolekülen in inversmizellaren Systemen in Verbindung mit Strukturanalysen ermöglicht eine selektive Steuerung des Aufarbeitungsprozesses.
Publications
- (2006), Extraction of nudeic acids using reverse micellar two-phase systems. International Symposium on the Separation of Proteins, Peptides, and Polynucleotides 2006, Innsbruck, Österreich
Streitner, N., Voß, C., Flaschel, E.
- (2006), Extraktion von Nukleinsäuren mittels inversmizellarer Zweiphasensysteme. Bioperspectives 2006, Wiesbaden
Streitner, N., Voß, C , Flaschel, E.
- (2007), Reverse micellar extraction systems for the purification of pharmaceutical grade plasmid DNA. J. Biotechnol. 131, 188-196
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- (2007). Extraction of Nudeic Acids using Reverse Micellar Two- Phase Systems. International Symposium on the Separation of Proteins, Peptides, and Polynucleotides 2007, Orlando, Florida, USA
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- (2007). Inversmizellare Extraktion zur Herstellung pharmazeutisch einsetzbarer Plasmid-DNA (Lecture). Dechema/GVC Vortrags- und Diskussionstagung, Osnabrück, Germany
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- (2007). Platform Technologies for Bioprocessing: Development of an Extraction Process for Nudeic Acids. Bioperspectives 2007, Cologne, Germany
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- (2008), Aufarbeitung von Plasmid-DNA für Gentherapie und genetische Impfung. Chem. Ing. Tech. 80, 795-802
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- (2008), Downstream processing of plasmid DNA for genetherapy and genetic vaccination. Chem. Eng. Technol. 31, 858-863
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- (2008), Isolierung von Plasmid-DNA durch invers mizellare Zweiphasensysteme - Optimierung der Rückextraktion. Chem. Ing. Tech. 80, 831-837
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- (2008), Plasmid manufacturing at the multigram scale. BlOforum Europe 1-2, 21-23
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- (2008). Plasmid purification by reverse micellar two-phase systems: devetopment of an extraction step and process integration (Lecture). International Symposium on the Separation of Proteins, Peptides, and Polynucleotides 2008, Baden-Baden, Germany
Streitner, N., Voß, C., Flaschel, E.
