Strukturanalyse der humanen Amyloid Precursor Protein (APP) intrazellulären Domäne (AICD) im Komplex mit dem Adaptorprotein Fe65 und dem Membranrezeptor
Final Report Abstract
Das Amyloid Precursor Protein (APP) ist ein integrales Typ I Membranprotein, dessen genaue Funktionen trotz intensiver Bemühungen noch nicht vollständig geklärt ist. Schon sehr lange bekannt ist allerdings, dass die für die Alzheimer Krankheit charakteristischen amyloiden Ablagerungen (amyloide Plaques) im Wesentlichen aus einem proteolytischen Abbauprodukt des APP bestehen. APP besitzt eine N-terminale extrazelluläre Ektodomäne, eine Transmembranregion und eine kurze C-terminale cytosolische Domäne (AICD: APP Intracellular Domain). Die Prozessierung von APP durch die β-Sekretase (BACE-1) und die γ-Sekretase generiert u.a. die pathologisch relevanten Amyloid-β Peptide (Aβ) und die lösliche AICD. Die AICD kann mit diversen cytosolischen Bindungspartnern interagieren, welche Transport, Prozessierung und transkriptionelle Aktivität von APP vermitteln bzw. modulieren. Aufbauend auf den Ergebnissen des Vorantrags war das Ziel des Vorhabens die biochemische Charakterisierung und die atomare Strukturaufklärung der AICD-Fe65-LRP1 Interaktion. Fe65 ist ein im Hirn angereichertes Adaptorprotein, welches eine zentrale Bedeutung vor allem für die Signaltransduktionsfunktion von APP besitzt. Aus den Voranträgen (mit US und EU Patentanmeldung) resultieren hiervon hochaufgelöste Röntgenstrukturen der AICD im Komplex mit der Fe65-PTB2 Bindedomäne und der Fe65-PTB1 Domäne alleine, welche das Bindeglied zu weiteren Proteininteraktionen darstellt. Wichtiger Bindepartner für Fe65-PTB1 ist das low density lipoprotein receptor – related protein (LRP1), welches die Signaltransduktionsfunktion sowie die Prozessierung von APP und die Produktion des Aβ-Peptids beeinflusst. Die Struktur ist somit wesentlich für ein detailiertes atomares Verständnis der physiologischen sowie pathologischen Funktionen von APP. Zur biochemischen Charakterisierung der Interaktionen innerhalb des ternären Komplexes wurden zunächst systematisch Gluthathion-S-Transferase basierte Pull-down Assays durchgeführt. Hierzu wurden verschiedene LICD-Konstrukte hergestellt, welche eine Diskriminierung der Bindung an die beiden NPxY-Endocytosemotife der LICD zuließen. Quantitative Tyrosin-Phosphorylierung innerhalb NPxY erfolgte durch rekombinante c-Src Kinase. Es konnte gezeigt werden, dass Fe65- PTB1 spezifisch an das phosphorylierte zweite NPxY-Motif der LICD bindet. Zur weiteren thermodynamischen und strukturellen Charakterisierung wurden 2D-NMR Experimente durchgeführt. Diese zeigten eine schwache Bindung von ca. 15 µM und eine relativ kleine Interaktionsfläche. SAXS Experimente zeigten einen flexiblen Charakter der Fe65-PTB1-2 Domänen, welcher nicht durch die LICD stabilisiert werden konnte. Leider scheiterte somit auch der Versuch der 3D-Strukturbestimmung mittels Röntgenstrukturanalyse (Struktur mit LICD-Peptiden durch Sulfat in Kristallisationsbedingung inhibiert) und auch 2D-NMR erwies sich als zu komplex und wird nicht fortgesetzt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der für die Alzheimer Krankheit relevante AICD-Fe65-LRP1 Komplex biochemisch charakterisiert und validiert werden konnte, jedoch aufgrund der intrinsischen Flexibilität und der relativen Schwäche der Interaktion eine hochauflösende 3D-Struktur nicht zugänglich war, und wahrscheinlich auch nicht zu bestimmen ist.
Publications
- Phosphorylation of LRP1 regulates the interaction with Fe65. (2011). FEBS Letters 585:3229-35
Klug W, Dietl A, Simon B, Sinning I & Wild K
