Application of the DNA microarray technology for a global characterization of human spermatogenesis and its disorders
Final Report Abstract
Hauptziel des zusammengefassten Projektes war die Identifikation globaler transkriptioneller Veränderungen während der Spermatogenese als auch die Beschreibung und Relevanz des Spermatozoen-Transkriptoms für den Erfolg bei der assistierten Reproduktion. Kurz vor Projektbeginn konnten wir die Relevanz von Genexpressionsstudien (Microarrays) zur Aufklärung der Mechanismen der einzelnen Spermatogenese-Stadien an Testis-Biopsien aufzeigen. Diese Ergebnisse sollten weitergeführt, als auch die entsprechende Methodik auf die Analyse von Ejakulaten übertragen werden, wobei hier speziell Korrelationen des Transkriptoms mit dem IVF-Outcome (Eizell-Fertilisierung/Schwangerschaft) im Fokus standen. Dieses Vorhaben geschah in Kooperation mit dem Fertility Center Hamburg (FCH). Dieser Teil des Projektes stellte sich aufgrund zweier Gründe als nicht vollständig zufriedenstellend heraus: (1) die Zahl der Ejakulate aus dem IVF-Programm war deutlich geringer als erwartet und (2) konnte mit der erhaltenen Probenzahl (25) keine für Microarray-Studien ausreichende statistische Trennleistung (Korrektur für multiples Testen) bezüglich des Outcomes erreicht werden, da sich die zelluläre Zusammensetzung der Ejakulate als extrem heterogen erwies. Das laufende Projekt kann jedoch zur Vergrößerung der Probenzahl benutzt werden. Zudem sind wir gerade dabei, Daten anderer Studien mit den unseren zu aggregieren, um die nötige Probenzahl für eine stringente und robuste statistische Analyse zu erhalten. Während der Probensammlung konnten jedoch einige Publikationen gemacht werden, bei denen die in unserer Abteilung etablierte Transkriptomanalyse Anwendung fand, hier speziell das testikuläre Transkriptom im Hintergrund von Y-chromosomalen Mikrodeletionen und auch bei der Differenzierung von humanen spermatogonialen Stammzellen. Die Re-Analyse älterer Daten von uns führten dazu, epigenetische Modifikationen mit dem Transkriptom zu korrelieren. Ferner konnten wir Referenz-Werte für Genexpressions-Studien des humanen Hoden definieren, um transkriptionelle Regulation von zellulärer Anreicherung abzugrenzen. Bei der von uns entwickelten Methode zur Isolierung hochreiner RNA von Spermatozoen konnten wir mittels sensitiver Kapillar-Elektrophorese ein spezifisches RNA-Bandenmuster von Ejakulaten identifizieren, wobei aufgereinigte Spermatozoen sich durch die Präsenz von 18S rRNA auszeichnen, während 28S rRNA nicht detektierbar ist. Diese Beobachtung widersprach dem bis dato herrschenden Dogma, dass Spermatozoen frei von rRNA sind. Wir vermuten, dass in Spermatozoen Ribosomen nicht assembliert werden sollen, um mögliche negative Effekte bei der Fertilisierung auszuschliessen. In der Arbeitsgruppe gibt es neben der Microarray-Analyse noch sehr detaillierte Kenntnisse der Methode der quantitativen real-time PCR. Der Bewilligungsempfänger ist Autor des „qpcR“-Paketes für die statistische Programmierungsumgebung R (http://cran.rproject.org/web/packages/qpcR/index.html). In Kooperation mit diversen Wissenschaftlern im In- und Ausland wurden in den letzten vier Jahren 4 Publikationen veröffentlicht, in denen die statistischen Analysemethoden dieser Technik optimiert wurden. Zusätzlich konnte auch eine Multiplex-real-time PCR zur Detektion von Y-chromosomalen Mikrodeletionen im Rahmen eines Studentenaustauschs mit der Universität Zagreb (Kroatien) entwickelt werden.
Publications
- Highly accurate sigmoidal fitting of real-time PCR data by introducing a parameter for asymmetry. BMC Bioinformatics. 2008 Apr 29;9:221
Spiess AN, Feig C, Ritz C
- qpcR: an R package for sigmoidal model selection in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis. Bioinformatics. 2008 Jul 1;24(13):1549-51
Ritz C, Spiess AN
- Expression of SNURF-SNRPN upstream transcripts and epigenetic regulatory genes during human spermatogenesis. Eur J Hum Genet. 2009 Nov;17(11):1463-70
Wawrzik M, Spiess AN, Herrmann R, Buiting K, Horsthemke B
- A biopsy sample reduction approach to identify significant alterations of the testicular transcriptome in the presence of Y-chromosomal microdeletions that are independent of germ cell composition. Hum Genet. 2010 Oct;128(4):421-31
Cappallo-Obermann H, von Kopylow K, Schulze W, Spiess AN
- An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacol. 2010 Jun 7;10:6
Spiess AN, Neumeyer N
- Screening for biomarkers of spermatogonia within the human testis: a whole genome approach. Hum Reprod. 2010 May;25(5):1104-12
von Kopylow K, Kirchhoff C, Jezek D, Schulze W, Feig C, Primig M, Steinkraus V, Spiess AN
- A one-step real-time multiplex PCR for screening Y-chromosomal microdeletions without downstream amplicon size analysis. PLoS One. 2011;6(8):e23174
Kozina V, Cappallo-Obermann H, Gromoll J, Spiess AN
- Highly purified spermatozoal RNA obtained by a novel method indicates an unusual 28S/18S rRNA ratio and suggests impaired ribosome assembly. Mol Hum Reprod. 2011 Nov;17(11):669-78
Cappallo-Obermann H, Schulze W, Jastrow H, Baukloh V, Spiess AN
- Differential marker protein expression specifies rarefaction zone-containing human Adark spermatogonia. Reproduction. 2012;143(1):45-57
von Kopylow K, Staege H, Spiess AN, Schulze W, Will H, Primig M, Kirchhoff C
(See online at https://doi.org/10.1530/REP-11-0290) - Evaluation of qPCR curve analysis methods for reliable biomarker discovery: Bias, resolution, precision, and implications. Methods. 2012 Sep 3. pii: S1046-2023(12)00229-0
Ruijter JM, Pfaffl MW, Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, Derveaux S, Hellemans J, Vandesompele J
(See online at https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.08.011) - Genome wide identification of promoter binding sites for H4K12ac in human sperm and its relevance for early embryonic development. Epigenetics. 2012 Sep 1;7(9)
Paradowska AS, Miller D, Spiess AN, Vieweg M, Cerna M, Dvorakova-Hortova K, Bartkuhn M, Schuppe HC, Weidner W, Steger K
(See online at https://doi.org/10.4161/epi.21556) - Fold-change correction values for testicular somatic transcripts in gene expression studies of human spermatogenesis. Hum Reprod. 2013 Jan 9. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 23303554
Cappallo-Obermann H, Feig C, Schulze W, Spiess AN
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