Directed evolution of DNA methyltransferases
Final Report Abstract
Ziel der Arbeiten war es mittels rationalem Design und gerichteter Evolution, die Spezifität von DNA-Methyltransferasen zu verändern. Am Beispiel der EcoDam-Methyltransferase, die DNA und GATC-Sequenzen methyliert, konnten wir eine Spezifitätsänderung mittels gerichteter Evolution erreichen. Hierbei wurden ausgewählte Regionen im Enzym mittels ungerichteter Mutagenese randomisiert, die Proteine in E. coli exprimiert und ihre Aktivität in E. coli-Zellen untersucht. In mehreren Zyklen war es so möglich EcoDam-Varianten herzustellen, die DNA auch an GATT-Sequenzen methylieren. Am selben System konnten wir mit rationalem Design den Verlauf der natürlichen Evolution beim Übergang vom E. coli-Enzym zu Enzymen der T4-Phagen nachvollziehen, bei der die Erkennung des ersten G der Zielsequenz von einer anderen Aminosäure übernommen wird. Interessanterweise verläuft dieser Übergang über ein Zwischenprodukt, das die katalytische Aktivität erhält. Weiterhin konnten wir zeigen, dass eine Erweiterung der Substratspezifität von DNA-Methyltransferasen durch DNA-Biegung erzielt werden kann. In einem komplementären Ansatz haben wir eine die DNA-Methylierung an unterschiedlichen CG-Erkennungsstellen durch die Maus-DNMT3A DNA-Methyltransferase untersucht. Anhand der Ergebnisse konnten optimale Substrate identifiziert werden. Versuche eine DNMT3A-Variante mit größerer Aktivität mittels Mutagenese und Selektion zu erzeugen, waren nicht erfolgreich, da die Selektion in Bakterien vor dem Hintergrund der natürlichen Mutationen nicht in ausreichendem Maße erreicht werden konnte. Eine solche Variante wäre für biotechnologische Anwendungen von Nutzen gewesen. Schließlich haben wir ein neuartiges Verfahren zur Charakterisierung von Protein/Protein-Interaktionsstellen entwickelt und validiert, das nach einer ungerichteten Mutagenese die Varianten isoliert, welche die Interaktion nicht stören. Nach Sequenzierung der entsprechenden Gene kann in 3D-Modellen des Proteins die Interaktionsstelle identifiziert werden. Zusammenfassend haben unsere Daten gezeigt, dass es mit Protein-Design möglich ist, die DNA-Erkennung von DNA-Methyltransferasen zu modifizieren. Es zeigte sich allerdings insbesondere bei den Ansätzen mittels gerichteter Evolution, dass die Anreicherung von Varianten mit den gewünschten Eigenschaften oft schwierig ist und deshalb die Entwicklung eines optimalen Screening- und Selektionssystems sehr wesentlich ist. Anwendungen wie das Kartieren von Protein-Interaktionsstellen, die auf weniger Selektionszyklen aufbauen, sind generell einfacher zu realisieren, als die Generierung einer neuen enzymatischen Eigenschaft.
Publications
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