Analysis of ISG15 effector functions in vivo
Final Report Abstract
Das Ubiquitin-ähnliche Protein "Interferon stimulated gene 15" (ISG15) wird durch Typ I Interferone induziert und analog zu Ubiquitin kovalent an Zielproteine konjugiert (ISGylierung). Diese Modifikation ist reversibel, wobei USP18 als entsprechende Protease wirkt. In dem Forschungsvorhaben sollte die Effektorfunktion der ISG15 näher untersucht werden. Als maßgebliches Modellsystem war die Untersuchung von Mäusen geplant, in denen eine Epitop-getaggte Variante von ISG15 (ISG15-FLAG HA) durch Doxycyclin induziert werden kann. Zu Beginn des Projektes war die Induzierbarkeit des verwendeten transgenen Konstruktes in Zellkultur getestet worden und es lagen bereits Tiere vor, die eine Integration des Transgens in das Genom aufwiesen. Unerwarteterweise zeigte dieses Mausmodell nach Verpaarung mit einer Transaktivatorlinie und näherer Untersuchung keine Expression von ISG15. Wir gehen davon aus, dass möglicherweis in den Mauslinien der Integrationslokus transkriptionell inaktiv ist. Aufgrund dieser Tatsache konnten wir die ursprünglich geplante Zielsetzung nicht weiterverfolgen und haben die Arbeiten auf mechanistische Aspekte der Interaktion von ISG15 mit USP18 konzentriert. Dies geschah auch vor dem Hintergrund, dass sich USP18 als der am Besten zu validierende ISG15 Interaktionspartner darstellte. Im Rahmen der Arbeiten konnten wir in gleichberechtigter Zusammenarbeit mit Günter Fritz erstmals rekombinantes, enzymatisch aktives USP18 exprimieren und aufreinigen, die Spezifität für ISG15 auf biochemischer Ebene aufzeigen und mit Huib Ovaa zusammen einen Hochdurchsatz kompatiblen Screen auf USP18 Inhibitoren etablieren. Als besonderes Highlight gelang es uns, im Rahmen dieses Projektes die Kristallstruktur von USP18 und des USP18/ISG15 Komplexes zu lösen. Die Strukturanalyse und darauf aufbauende Experimente ermöglichten es uns, die molekularen Determinanten zu charakterisieren, über die USP18 spezifisch an ISG15 bindet und evolutionäre Aspekte dieser Interaktionsfläche näher zu beleuchten. Die entsprechenden Ergebnisse wurden vor kurzem in Nature Structural and Molecular Biology veröffentlicht.
Publications
- High yield expression of catalytically active USP18 (UBP43) using a Trigger Factor fusion system. BMC Biotechnol. 2012 Aug 23;12:56
Basters A, Ketscher L, Deuerling E, Arkona C, Rademann J, Knobeloch KP, Fritz G
(See online at https://doi.org/10.1186/1472-6750-12-56) - Molecular characterization of ubiquitin-specific protease 18 reveals substrate specificity for interferon-stimulated gene 15. FEBS J. 2014 Apr;281(7):1918-28
Basters A, Geurink PP, El Oualid F, Ketscher L, Casutt MS, Krause E, Ovaa H, Knobeloch KP, Fritz G.
(See online at https://doi.org/10.1111/febs.12754) - Structural basis of the specificity of USP18 toward ISG15. Nat Struct Mol Biol. 2017 Mar;24(3):270-278
Basters A, Geurink PP, Röcker A, Witting KF, Tadayon R, Hess S, Semrau MS, Storici P, Ovaa H, Knobeloch KP, Fritz G
(See online at https://doi.org/10.1038/nsmb.3371)
