Function of alternatively spliced regulatory isoforms of PI3K
Final Report Abstract
Die regulatorische Untereinheit der Phosphoinositid 3-Kinase (PI3K) p85a stammt vom Pik3rl-Gen ab ebenso wie die alternativ gespleißten Untereinheiten p50a und p55a. In insulinsensitiven Geweben inhibiert ein Exzess von freiem monomerischen p85alpha die funktionell aktive p85-pl 10 Heterodimer-Bildung der PI3K. Über die Funktion von regulatorischen Untereinheiten des Pik3rl-Gens in insulinproduzierenden Zellen ist jedoch wenig bekannt. Wir untersuchten die Expression und Signaltransduktion der Pik3rl-Genprodukte in der glukose-sensitiven Insulinomazelllinie INS-1 E, die mit IGF-1 stimuliert wurde. Die regulatorischen Isoformen der PI3K p85ct, p55a und p50a wurden durch siRNA Transfektion reduziert bezw. durch adenovirale Infektion überexprimiert. Lipidkinase-Assays wurden mit Phosphoinositol als Substrat durchgeführt. Die Aktivierung der Proteinkinase B (PKB), der p70S6-Kinase und der Glykogensynthasekinase (GSK) wurden mit aktivierungsspezifischen Antikörpern untersucht. Die Zellzyklusregulation and Apoptoserate wurde mittels FACS bestimmt. Zuerst wurde Expression aller 3 regulatorischen Untereinheiten der PI3K p85a, p55a und p50a zusammen mit der katalytischen Untereinheit pi 10a in INS-IE Zellen und Ratteninseln gezeigt. Serielle Immunopräzipitationen demonstrierten ein Übermaß an freien regulatorischen Isoformen im Vergleich zu pl 10. Der 50%ige Herunterregelierung von p85a durch si-RNA führte zu einer vermehrten Phosphorylierung der PKB. Im Gegensatz führte eine vermehrte Expression von p85a durch adenoviralen Gentransfer zu einer verminderten Phosphorylierung der PKB, was eine inhibitorische Rolle eines Exzesses an monomerischen p85a in INS-IE Zellen anzeigt. Auch eine Überexpression von p55a und p50a inhibierten die PKB, allerdings wirkte p50a erst in höheren Dosen als Inhibitor der PKB. Zusätzlich aktivierte ein Exzess an p50a aber nicht die anderen regulatorischen Untereinheiten die Stresskinase p38 und führte zu einer Zellzyklusveränderung durch vermehrte S-Phasen Anteil. Eine Induktion des zytotoxischen Zelltodes durch Interleukin Iß bewirkte in INS-1E Zellen eine Hochregulierung der kleinen regulatorischen Isoform p50a. Eine selektive Überexpression von p50a aber nicht von p85a oder p55a bewirkte eine Protektion vor Apoptose in INS-1E Zellen, die mit Interleukin Iß stimuliert worden waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass p85a und p55a vor allem als Inhibitoren der PKB wirken, wenn sie im Übermaß vorhanden sind. Demgegenüber wirkt ein Exzess an p50a als eine Verbindung zwischen Proliferation und Aktivierung von Stresskinasen in Insulinomazellen und könnte so eine Verbindung zwischen Proliferation und Apoptose zum Beispiel beim Diabetes Typ I und II darstellen.
