Quantitative proteomics using novel trifunctionalized metal coded affintiy tags
Final Report Abstract
Die quantitative Analyse von Proteingemischen ist für das Erkennen und Verstehen von Veränderungen in Proteomen von Lebewesen grundlegend. Deshalb wurden in der jüngsten Vergangenheit Verfahren entwickelt, die die relative quantitative Analyse von Peptiden und Proteinen erlauben. Im Rahmen des Projektes wurde ein Verfahren entwickelt, das eine differenzielle, quantitative und qualitative Proteomcharakterisierung erlaubt. Makrozyklische Metallchelatkomplexe (1,4,7,10- Tetraazacyclododecan- 1,4,7,10-Tetraessigsäure, DOTA), die unterschiedliche Lanthanoidionen enthalten, bilden den Hauptbestandteil der Markierungsreagenzien. Durch die Kombination von DOTA mit einem Affinitätsanker zur Aufreinigung und einer reaktiven Gruppe für die Bindung an Aminosäuren erhält man Reagenzien, die die absolute Quantifizierung von Peptiden und Proteinen ermöglichen. Für die quantitative Bestimmung werden die markierten Peptide und Proteine mittels Fließinjektions-ICP-MS analysiert, einer Methode, die die Detektion der Metalle mit hoher Präzision und sehr niedrigen Detektionsgrenzen erlaubt. Die Metallchelatkomplexe wurden an Cysteine oder alternativ an endständige Aminogruppen gebunden. Der Verlauf der Markierung wurde mittels Gelelektrophorese und unterschiedlichen massenspektrometrischen Methoden untersucht. Um übersichtliche Isotopenmuster zu erhalten und die Empfindlichkeit der ESI-MS zu erhöhen, wurden nur monoisotope Lanthanoidionen bzw. jene mit einem Hauptisotop >97% für die Reagenzien verwendet. In MECAT (früher: Mecore) Anwendungen an Proteinen wurden Nachweisgrenzen von 110 attomol z.B. für Bovin Serum Albumin bestimmt. Als Modellproteom wurden die Proteine von Sus scrofa Augenlinsen verwendet. Das Verfahren wurde mit N- und C-funktionalisierten MECAT Reagenzien durchgeführt. Beide Reagenzientypen erfüllen die Bedingung, dass die mit unterschiedlichen Metallionen komplexierten MECATs und deren Peptidkonjugate auf HPLC-Säulen koeluieren. Wir konnten zeigen, dass das MECAT Verfahren eine Alternative zu praxiserprobten Proteomics Methoden wie ICAT und iTRAQ darstellt. Die Methode soll künftig Anwendung für die Quantifizierung von intakten Proteinen in komplexen Mischungen finden. Unsere Ergebnisse konnten wir u.a. im Journal "Molecular and Cellular Proteomics" publizieren.
Publications
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