Structure of Nickel/Cobalt Permeases (NiCoT; TC 2.A.52)
Final Report Abstract
Nickel/Cobalt Transporter (NiCoT, TC 2.A.52), eine Familie von sekundären Einkomponenten-Transportern, vermitteln in vielen Prokaryoten und manchen Pilzen die hochaffine Aufnahme von Ni2+ und Co2+-Ionen. Verwandte Proteine mit auffälliger Sequenzähnlichkeit sind in Pflanzen weit verbreitet. Nachdem in vorangegangenen Untersuchungen zur rekombinanten Überproduktion und Reinigung geeignete Orthologe selektiert wurden, standen Ansätze zur strukturellen Chrakterisierung im Vordergrund des jetzigen Berichtszeitraums. Ein weiterer Ansatz – die Charakterisierung der Metallbindung an NiCoT durch verschiedene spektroskopische Verfahren – wurde hingegen nicht weiter verfolgt, da sich der ursprünglich auf UV-Vis-Spektroskopie beruhende vermeintliche Nachweis gebundenen Metalls in folgenden Analysen als nicht reproduzierbar erwies. Der NiCoT (RpNiCoT) aus dem Purpurbakterium Rhodopseudomonas palustris wurde zur Gewinnung von 2D- und 3D-Kristallen eingesetzt. Das konzentrierte Protein konnte in Proteoliposomen eingebaut werden, jedoch erlaubten weder Dialyse- noch Verdünnungsverfahren die Gewinnung zweidimensionaler Kristalle. Zur dreidimensionalen Strukturanalyse wurde im Berichtszeitraum eine Variante von RpNiCoT mit dem inaktivierenden D64E-Aminosäureaustausch konstruiert. Durch den Austausch sollte die Eigendynamik des Proteins verringert und damit die Tendenz zur Kristallisation erhöht werden. Tatsächlich konnte diese Variante – im Gegensatz zum Wildtyp – in monodisperser Form isoliert werden. In Kristallisations-Screens wurden unter definierten Bedingungen reproduzierbar kristalline Partikel erhalten, deren Röntgenbeugungsmuster jedoch keinen interpretierbaren Datensatz lieferte. Im Rahmen von bioinformatischen Analysen zur globalen Charakterisierung der Aufnahme von Ni2+- und Co2+-Ionen in Prokaryoten wurden Kandidaten für energieabhängige Transporter (OMT) in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien und für eine unter Prokaryoten weit verbreitete neue Klasse – die ECF-Transporter – von ABC- (ATP-Bindekassette enthaltende)-Transportern identifiziert. Ein Vertreter der OMT wurde rekombinant in E. coli überproduziert. Die in internationaler Zusammenarbeit vorgenommene Beschreibung von ECF-Transportern als Aufnahmesysteme für Übergangsmetalle und Vitamine eröffnete ein neues Forschungsfeld.
Publications
- (2009) Untersuchungen zur Struktur und Funktion primär und sekundär aktiver Transporter für Übergangsmetallkationen – ein neuartiger Mechanismus der Substrataufnahme in Prokaryoten. Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin
Hebbeln, Peter
