Faltung und Stabilität von Außenmembranproteinen am Beispiel des hVDAC-1 Kanals (Mensch) und des Außenmembranproteins A (E. coli)

• Applicant: Professor Dr. Jörg H. Kleinschmidt
• Subject Area: Biophysics
• Term: from 2003 to 2011
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5400503

• Final Report Year: 2009

Final Report Abstract

Der Einbaumechanismus und die Faltung von Transmembranproteinen sind bislang nur schlecht verstanden und wurden hinsichtlich der biophysikalisch-chemischen Prinzipien nur für wenige Membranproteine untersucht. In diesem Projekt haben wir erstmals für ein eukaryotisches ß-Fassmembranprotein, nämlich den spannungsabhängigen Anionen-selektiven Kanal VDAC (Human-Isoform 1), zeigen können, dass dieses Außenmembranprotein (OMP) spontan aus einem denaturierten Zustand in 8 M unter HamstoffVerdürmung mit einer Ausbeute >90 % in Lipid-Doppelschichten aus Phosphatidylcholin falten kann. Die Einzelkanalleitfähigkeit des gefalteten VDAC betrug ≈4.3 nS (bei 10 mV und 1 M KCl) und zeigte die erwartete Spannungsabhängigkeit. Die Faltung und die Stabilität des VDAC waren stark pH- abhängig. VDAC entwickelte im Gegensatz zu den von uns untersuchten bakteriellen ß-Fass Membranproteinen bereits in wässeriger Lösung in Abwesenheit von Lipid oder Detergens nach Verdünnung des Denaturierungsmittels sehr große Anteile an ß-Faltblattstmktur. Dies zeigt, dass die Ausbildung eines amphipathisehen ß-Faltblattes nicht zwingend die apolar/polare Schnittstelle der Membran voraussetzt. Die Geschwindigkeit des Membran-Einbauprozesses hängt dabei von der Beschaffenheit der Lipid-Doppelschicht ab und ist umso größer, je kürzer die Fettsäurekettenlänge der Lipide ist. Basierend auf früheren Untersuchungen, die zeigten, dass das die periplasmatische Chaperone Skp (seventeen kilodalton protein) die Faltung und den Membraneinbau von Außenmembranprotein A (OmpA) unterstützt, haben wir den Komplex aus entfalteten OMPs und Skp hinsichtlich der OMPs näher untersucht. Skp bindet an bakterielle OMPs, nicht jedoch an VDAC. Dabei bildet das Skp-Trimer mit hoher Affinität 1:1 Komplexe mit den OMPs aus. Topologische Untersuchungen mit ortsgerichteter Fluoreszenzspektroskopie zu Segmenten der OmpA Polypeptidkette, die an Skp binden, zeigten, dass Skp offenbar die gesamte Membrandomäne des OmpA im entfalteten Zustand an Skp bindet. Damit OmpA aus einem Komplex mit Skp in Membranen falten kann, müssen diese Membranen negativ geladene Lipide enthalten. Um eine Faltungsmethoden für Membranproteine zu optimieren, haben wir zusammen mit der Arbeitgruppe von Jean-Luc Popot den Einsatz von amphipathischen Polymeren (APols) für die effiziente Rückfaltung und Stabilisierung von Membranproteinen erprobt. Dabei konnten wir zeigen, dass die bakteriellen ß-Fass Membranproteine in das anionische Apol A8-35 zurückfalten kann. Aus dem Projekt sind bislang 6 Publikationen in intemationalen Fachjournalen hervorgegangen. Zwei Doktorarbeiten wurden im Rahmen dieses Projektes angefertigt und erfolgreich abgeschlossen. Das Projekt erschloss uns zahlreiche Perspektiven und Kooperationen für zukünftige Arbeiten sowohl zu VDAC als auch zu Skp.

Publications

• 2006. Amphipathic Polymers: Tools to Fold Integral Membrane Proteins to their Active Form. Biochemistry 45, 13954-13961
  Pocanschi, C. L., Dahmane, T., Gohon, Y., Rappaport, F., Apell, H.-J., Kleinschmidt, J. H., Popot, J.- L.
  
• 2006. Folding and Membrane Insertion of a Eukaryotic Porin, VDAC (human isoform 1) into Phospholipid Bilayers. Biophysical Society Meeting, Salt Lake City, UT, USA. February 2006. Biophys. J. 90,491 A
  Shanmugavadivu B., Apell, H.-J., Zeth, K., and Kleinschmidt, J.H.
  
• 2006. Membrane elastic fluctuations and the insertion and tilt of β-barrel proteins. Biophys. J. 91, 227-232
  Marsh, D., Shanmugavadivu, B., and Kleinschmidt, J.H.
  
• Membrane protein insertion and folding. The voltage-gated anion-selective channel VDAC. Workshop on Lipid-Protein Interactions, Murcia, Spain. 27-29. April 2006
  Kleinschmidt, J. H.
  
• 2007. Characterizing Solubilized Membrane Proteins by Circular Dichroism Spectroscopy. International Student Workshop, Roscoff, France. 23.-27. April 2007
  Kleinschmidt, J. H.
  
• 2007. Correct folding of the β-barrel of the human membrane protein VDAC requires a lipid bilayer. J. Mol. Biol. 368, 66-78
  Shanmugavadivu, B., Apell, H.-J., Meins, T., Zeth, K., Kleinschmidt, J. H.
  
• 2007. Insertion and folding of β-Barrel Membrane Proteins into Phospholipid Bilayers. Universität Basel, Biozentrum, Basel, Switzerland, 21. May 2007
  Kleinschmidt, J. H.
  
• 2007. Membrane protein folding for OmpA of E. coli and for VDAC of human mitochondria. Coupling of membrane insertion and folding for β-barrel membrane proteins. "Intemational Training Course on Membrane Proteins", Aalborg, Denmark. 29.-31. May 2007
  Kleinschmidt, J. H.
  
• 2007. Renaturing Membrane Proteins of either β-Barrel or α-Helix Bundle Transmembrane Structure. Intemational Student Workshop, Roscoff, France. 23.-27. April 2007
  Kleinschmidt, J. H.
  
• 2007. The periplasmic chaperone Skp of E. coli forms 1:1 complexes with outer membrane proteins via hydrophobic and electrostatic interactions. J. Mol. Biol. 374, 91-105
  Qu, J., Mayer, C., Behrens, S., Holst, O., Kleinschmidt, J. H.
  
• Dissertation, Konstanz 2007
  Shanmugavadivu, Baladhandapani
  
• Dissertation, Konstanz 2007
  Qu, Jian
  
• 2007. Binding sites of outer membrane protein A from Escherischia coli in the complex with the periplasmic chaperone Skp. A site-directed fluorescence study. "Control, Co-ordination and Regulation of Protein Targeting and Translocation", Ste. Maxime, France. 25.-29. October 2008
  Kleinschmidt, J. H.
  
• The periplasmic chaperone Skp of E. coli forms 1:1 complexes with outer membrane proteins via hydrophobic and electrostatic interactions. Biophysical Society Meeting, Long Beach, CA, USA. Jan 31.-Feb. 6, 2008. Biophys. J. 94, P648 (1924- Pos)
  Qu, J., Mayer, C., Behrens, S., Holst, O., Kleinschmidt, J. H.
  
• 2009. Binding regions of outer membrane protein A from Escherischia coli in complexes with the periplasmic chaperone Skp. A site-directed fluorescence study. Biochemistry
  Qu, J., Behrens-Kneip, S., Holst, O., Kleinschmidt, J. H.
  (See online at https://dx.doi.org/10.1021/bi9004039)
• 2009. Binding sites of outer membrane protein A from Escherischia coli in the complex with the periplasmic chaperone Skp. A site-directed fluorescence study. Biophysical Society Meeting, Boston, MA, USA. Feb 28.-Mar. 4, 2009. Biophys. J. 96,449a- 450a
  Qu, J., Behrens, S., Holst, O., Kleinschmidt, J. H.
  
• 2009. Skp-assisted Folding and Insertion of Outer Membrane Protein A into Lipid Membranes is controlled by Charge-Charge Interactions. Biochemistry 48, 10235-10245
  Patel, G. J., Behrens, S., Holst, O., Kleinschmidt, J. H.
  
• Skp-assisted Folding and Insertion of Outer Membrane Protein A into Lipid Membranes is controlled by Charge-Charge Interactions. Biophysical Society Meeting, Boston, MA, USA, Feb 28.-Mar. 4, 2009. Biophys. J. 96,449a
  Patel, G. J., Behrens, S., Holst, O., Kleinschmidt, J. H.