Molecular mechanisms of cAMP-mediated signaltransduction
Final Report Abstract
Der sekundäre Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert viele fundamentale Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Energiemetabolismus und Genexpression. In eukaryotischen Zellen vermittelt die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) die meisten biologischen Funktionen von cAMP. PKA besteht aus einem Holoenzymkomplex zweier regulatorischer (R) und katalytischer (C) Untereinheiten, der durch cAMP aktiviert wird, indem die C-Untereinheit dissoziiert und nun Substrate im zellulären Kontext phosphorylieren kann. In dem abgeschlossenen Projekt wurde zum einen die Bindung von cAMP und cAMP-Analoga an die R-Untereinheit der PKA unter funktionellen und mechanistischen Aspekten untersucht. Dazu wurden mit cAMP und cAMP-Analoga thermodynamische Studien (ITC) im direkten Vergleich mit kinetischen Analysen (Oberflächenplasmonresonanz (SPR)) durchgeführt, um thermodynamische Signaturen für das Bindungsverhalten der Nukleotide an die R-Untereinheit der PKA zu erstellen. Mittels mutagenisierten R-Untereinheiten wurde der Aktivierungsmechanismus der PKA untersucht und basierend auf verschiedenen Modellen der cAMP-induzierten Konformationsänderung ein Mechanismus für PKA entwickelt. Neue Festphasen gebundene cAMP-Analoga (Agonisten und Antagonisten) sollen in einem (sub)proteomischen Ansatz genutzt werden, natürliche Komplexe der R-Untereinheit und des PKA-Holoenzyms aus Zelllysateh zu isolieren und zu identifizieren. Diese Untersuchungen fließen letztlich in einem systembiologischen Ansatz zusammen, der neue Einblicke in die vielschichtigen cAMP gesteuerten Netzwerke und Regulationsprozesse erlaubt. In einem zweiten Teilprojekt wurde sehr erfolgreich die isoformspezifische Regulation einer humanen Isoform der C-Untereinheit, der Proteinkinase X (PrKX), untersucht. Dazu konnte PrKX funktionell intakt und katalytisch aktiv in einem eukaryotischen Expressionssystem hergestellt und biochemisch charakterisiert werden. Mit in vitro (SPR) und in vivo Methoden (BRET) wurde festgestellt, dass die isoformspezifische Regulation auf Interaktionen mit der Pseudosubstratbindestelle der R-Untereinheiten beruht. Neue Phosphorylierungsstellen wurden anhand von Primärsequenzanalysen identifiziert und mittels zielgerichteter Mutagenese untersucht. Letztendlich sind die Ergebnisse aus beiden Teilprojekten eine Voraussetzung für das Verständnis Gewebe- und Kompartiment-spezifischer cAMP Wirkung in höheren Zellen.
Publications
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