Doppelstrangbruch-Reparatur-Komplexe: Dynamik und Regulation der Rekombinations-Überwachung durch Tumorsuppressoren
Final Report Abstract
Chromosomale DNA-Doppelstrangbrüche (DSBe) repräsentieren eine der schwersten DNA-Schädigungen. Sie können von außen durch Strahlung oder Erbgut schädigende Agenzien, aber auch im Körper durch natürliche Prozesse erzeugt werden. In Säugerzellen existieren drei Reaktionswege zur Reparatur von DSBen: die homologe Rekombination (HR), das Single-Strand Annealing (SSA), und das Non-Homologous End Joining (NHEJ). Zellen, in welchen der Tumorsuppressor p53 ausgeschaltet wurde, also der Faktor, welcher in über der Hälfte aller Krebsformen mutiert ist, weisen gehäuft chromosomale Aberrationen auf. Um die molekulare Ursache dieser genetischen Instabilitäten zu verstehen, prüften wir vor Beginn dieses Förderabschnittes eine Involvierung bei der DNA-Reparatur und demonstrierten, dass p53 DSB-Reparatur reguliert, indem es fehlerhafte Prozesse bei der HR verhindert. p53 unterdrückt damit Genom-Rearrangements, z.B. zwischen natürlich im Genom vorkommenden repetitiven Sequenzen. Diese Beobachtungen bildeten die Grundlage für die Hypothese, dass p53 die Genauigkeit von HR-Prozessen kontrolliert, ähnlich wie der gut charakterisierte Mismatch-Reparatur-Faktor und Tumorsuppressor MSH2, dessen Inaktivierung die häufigste Ursache des Hereditären Nicht-Polypösen Kolon-Karzinoms (HNPCC)-Karzinomen darstellt. Nach der grundsätzlichen Darstellung einer HR-Regulation durch p53 stellte sich nun die Frage nach der Beziehung dieser Funktion zu den bereits bekannten Tumorsuppressor-Aktivitäten und in diesem Zusammenhang auch nach eventuellen Umschaltmechanismen zwischen den diversen Funktionen. Darüberhinaus sollte in Analogie zu p53 die präzise Rolle der Mismatch-Reparatur-Faktoren in der DSB-Reparatur aufgeschlüsselt werden. Zur Klärung dieser Fragen setzten wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie, biochemische Methoden und das in unserem Labor entwickelte Fluoreszenz-basierte Verfahren zum quantitativen und qualitativen Nachweis sämtlicher DSB-Reparatur-Mechanismen in lebenden Zellen ein. Dieses Testverfahren applizierten wir auf verschiedenste menschliche Zell-Systeme mit Profizienz oder Defizienz für interessante DSB-Proteine und nach Rekonstitution durch Wiedereinführung des Faktors in der ursprünglichen oder einer gezielt mutierten Form. Alternativ inaktivierten wir die Faktoren von Interesse durch die sogenannte RNA-Interferenz-Methode oder die Gabe von chemischen Inhibitoren. Auf diese Weise konnten wir die Beweise dafür erhärten, dass p53 unabhängig von den lange beschriebenen Aktivitäten in der Transkription, der Einleitung des Zellzyklus-Arrestes und der Apoptose-Induktion HR herabreguliert. Unsere biochemischen und mikroskopischen Experimente ergaben, dass diese Inhibition während der frühen Prozesse des DNA-Austausches durch die Rekombinase RAD51 ausgeübt wird. Im Verlaufe unserer Studien stellte sich als große Überraschung heraus, dass p53 unter bestimmten Bedingungen HR auch aktivieren kann und zwar über das Enzym Topoisomerase an geöffneten DNA-Strukturen während der DNA-Synthese. Wir entdeckten weiter, dass Phosphorylierung von p53 an Serin 15 durch die Kinasen ATM oder ATR HR-Inhibition anschaltet, während Phosphorylierung von p53 an Serin 315 durch Cyclin A1/CDK2 die neuentdeckte HR-Stimulation induziert. Die HR-stimulierende Wirkung wird insbesondere von p53-Mutanten, die bei Krebspatienten auftauchen, ausgeübt. Diese Mutanten können aber gleichzeitig die Genauigkeit der HR nicht mehr kontrollieren, so dass nach p53-Mutation vermehrt genomische Instabilitäten entstehen, die die Tumor-Progression beschleunigen. Unsere mechanistischen Analysen zu Mismatch-Reparatur-Faktoren demonstrierten, dass diese HR unabhängig von p53 regulieren. Eine äußerst überraschende Beobachtung machten wir in Bezug auf MLH1, PMS1 und PMS2, für welche man aufgrund von Experimenten in der Hefe bisher davon ausgegangen war, dass diese HR nach Erkennung von Basen-Fehlpaarungen durch MSH2 herabregulieren. Unsere Daten in zehn menschlichen Zellsystem erbrachten jedoch den Beweis, dass MLH1 diese Funktion unabhängig von MSH2 ausübt. Unsere Ergebnisse sprechen eher für die Involvierung der DNA-Schadens-Signaltransduktions-Kinasen ATM und ATR. Insgesamt erbrachten unsere Ergebnisse eine signifikante Änderung des bisherigen Bildes der Genom stabilisierenden Rolle von p53 und M/smatcri-Reparatur-Faktoren und damit deren Wirkungsweise als Tumorsuppressoren.
Publications
- (2003). p53 mutated in the transactivation domain retains regulatory functions in homology-directed double-strand break repair. Oncogene 22, 4111-4117
Beenden, G.S., Akyüz, N., Roemer, K. and Wiesmüller, L.
- (2004). p53 inhibits strand exchange and replication fork regression promoted by human Rad51. J. Mol Biol. 336, 639-654
Yoon, D., Stapleford, K., Wiesmüller, L, and Chen, J.
- (2004). Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1) and p53 independently function in regulating double strand break repair in primate cells. Nucleic Acids Res. 32, 669-680
Süsse, S., Scholz, C.-J., Bürkle, A., and Wiesmüller, L.
- (2004). The Cyclin A1-CDK2 complex regulates DNA double strand break repair. Mol Cell Biol. 24, 8917-8928
Müller-Tidow, C., Ji, P., Diederichs, S., Potratz, J., Bäumer, N., Köhler, G., Cauvet, T., Choudary, C., van der Meer, T., Chan, W.-Y.I., Nieduszynski, C., Colledge, W.H., Carrington, M., Koeffler, H.P., Restle, A., Wiesmüller, L., Sobczak-Thepot, J., Berdel, W.E., and Serve, H.
- (2005) The 'regulatory' beta-subunit of protein kinase CK2 negatively influences p53-mediated allosteric effects on Chk2 activation. Oncogene 24, 6194-6200
Bjorling-Poulsen, M., Siehler, S., Wiesmüller, L, Meek, D., Niefind, K., Issinger, O.G.
- (2005). Differences in the association of p53 phosphorylated on serine 15 and key enzymes of homologous recombination. Oncogene 24, 4380-4387
Restle, A., Janz, A., Wiesmüller, L.
- (2006) Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) antagonizes topoisomerase l-dependent recombination stimulation by p53. Nucleic Acids Res. 34, 1036-1049
Baumann, C., Boehden G.S., Bürkle, A., and Wiesmüller, L.
- (2006). p53 in recombination and repair. Cell Death Differ. 13, 1003-1006
Gatz, SA. and Wiesmüller, L.
- (2006). Role of p53 in double-strand break repair. In: Facets of Genome Integrity (Lankenau, D.H., ed.), Springer Verlag
Gatz, SA., and Wiesmüller, L.
