Verborgene Schätze der bakteriellen Eugenol-Oxidase Flavoprotein-Familie: Vielseitige Biokatalysatoren

• Antragsteller: Professor Dr. Dirk Tischler
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 538360990

Flavine, insbesondere Flavinmononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD), sind allgegenwärtige Cofaktoren, die in allen Lebewesen vorkommen. Aufgrund definierterRedoxeigenschaften unterstützen sie Proteine und verwandeln sie in leistungsstarke Katalysatoren für komplexe Reaktionen. Letztere sind meist Redoxreaktionen, bei denen der Redoxzustand der Flavine verändert wird. Dies geht einher mit Veränderungen der spektralen Eigenschaften der Holoenzyme und genauer gesagt des Cofaktors selbst. Daher können die definierten Redoxzustände von Flavinen verwendet werden, um Enzymkinetiken zu untersuchen und Reaktionsmechanismen aufzudecken. In diesem Projektantrag stützen wir uns auf eine gerade gelöste Kristallstruktur einer neuen bakteriellen FAD-abhängigen Eugenol-Oxidase, SspEUGO genannt. Eine phylogenetische Studie, Homologiemodellierung und Molekulardynamik veranlassten uns, dieses Enzym zu untersuchen, da es im Vergleich zu bisher untersuchten toleranter gegenüber Substraten sein sollte, da es eine größere katalytische Tasche aufweist. Der Prototyp dieser FAD-abhängigen Enzymklasse ist die Vanillylalkohol-Oxidase (VAO), was sich auch in der Bezeichnung wieder spiegelt; VAO-Familie (EC 1.1.3.38). Entsprechende Enzyme enthalten einen kovalent gebundenen FAD-Cofaktor, der für die Substratoxidation relevant ist. Das Enzym ist in Bezug auf Biochemie und Biokatalyse lange bekannt und gut untersucht. Da es ursprünglich aus dem Pilz Penicillium simplicissimum gewonnen wurde, ist VAO leider schwer rekombinant herzustellen. Daher wurde nach bakteriellen Vertretern gesucht, wovon bisher nur zwei teilweise beschrieben wurden. Dies sind die Eugenol-Oxidase (EUGO) aus Rhodococcus jostii und die 4-Ethylphenol-Oxidase (Gc4EO) aus Gulosibacter chungangensis. Diese Oxidasen akzeptieren phenolähnliche Substrate wie Vanillylalkohol oder Eugenol. Diese werden verwendet, um das FAD zu reduzieren und dabei wird ein para-Chinonmethid-Intermediat gebildet, welches in Abhängigkeit von der Struktur des Substrats zum Produkt oxidiert wird. Dann wird reduziertes FAD durch molekularen Sauerstoff reoxidiert und Wasserstoffperoxid als zweites Produkt gebildet. Es sind jedoch noch Fragen zum Mechanismus offen, wie 1) pH-Abhängigkeit von reduktiver und oxidativer Halbreaktion, 2) Substrataktivierung durch eine katalytische Triade und deren Flexibilität, 3) Sauerstoffreaktion als Geschwindigkeitsbegrenzung und 4) welche FAD-Spezies treten während der Katalyse auf. Bakterielle VAO-ähnliche Oxidasen, einschließlich SspEUGO, können leicht mit hohen Ausbeuten hergestellt und vollständig mit FAD gesättigt erhalten werden. Somit können sie als Modellenzyme fungieren, um den Mechanismus genauer zu untersuchen. Das Wissen über die Struktur-Funktions-Beziehung wird es weiterhin ermöglichen, diese und verwandte Enzyme zu optimieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen