Struktur und Regulation von Pleckstrin in der Signaltransduktion von Blutplättchen

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Das Pleckstrin Protein kommt in hohen Konzentrationen in Blutplättchen und Leukozyten vor. Die Phosphorylierung von Pleckstrin durch Protein Kinase C (PKC) stimuliert zelluläre Signaltransduktionswege und ist ein charakteristischer Indikator für die Aktivierung von Blutplättchen. Das vorliegende Projekt liefert strukturelle und biochemische Grundlagen zum Verständnis der molekularen Funktionen des menschlichen Pleckstrin Proteins. Hierbei wurde ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der NMR-Spektroskopie, in Lösung Röntgenstrukturanalyse und Kleinwinkelstreuexperimente kombiniert. Phosphorylierung und die Wechselwirkung mit Phospholipiden wurden in biochemischen Experimenten und mittels NMR untersucht. Wir haben die drei-dimensionale Struktur der DEP and PH2 Domänen von Pleckstrin bestimmt. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die PH2 Domäne Phosphatidylinositol (3,4) bisphosphat (PtdIns(3,4)P2) mit hoher Selektivität bindet, und dass diese Domäne strukturell unabhängig vom PH1-DEP Modul ist. Umfangreiche NMR und biochemische Untersuchungen von Wildtyp und phosphorylierten Doppeldomänkonstrukten zeigen, dass die Phosphorylierung von Pleckstrin eine intramolekulare Wechselwirkung der PH1 und DEP Domänen aufhebt und dadurch die Phospholipid Bindungstasche der PH1 Domäne zugänglich macht. Aufgrund der Resultate dieses Projektes schlagen wir ein Model für die molekularen Funktionen von Pleckstrin vor. Unsere Strukturuntersuchungen haben gezeigt, dass Wildtyp Pleckstrin eine geschlossene Konformation einnimmt, in der die PH1 und DEP Domänen in einer kompakten Anordnung vorliegen. Phoshorylierung des PH1-DEP Linkers führt zu einer offenen Konformation, in der die Phospholipidbindungstasche der PH1 Domäne zugänglich wird. Es erscheint daher möglich, dass die PtdIns(3,4)P2 Bindung der PH2 Domäne, und die bekannte, weniger selektive Interaktion von PH1 mit PtdIns(4,5)P2 zu einer verstärkten und spezifischen Membraninteraktion von Pleckstrin führen. Alternativ könnte es sein, dass die durch Phosphorylierung induzierten Konformationsänderungen die Bindung an (noch nicht bekannte) Proteine in der Pleckstrin Signaltransduktionskette ermöglichen. Die Ergebnisse des vorliegenden Projektes liefern neue und unerwartete Erkenntnisse bezüglich der strukturellen Konsequenzen der Phosphorylierung von Pleckstrin sowie die räumliche Anordnung der Pleckstrin PH1, DEP und PH2 Domänen, die eine wichtige Rolle für dessen molekularen Funktionen haben. Die Strukturuntersuchungen waren ein Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer FRET basierter Sensoren, die es gestatten PKC Aktivität in lebenden Zellen zu untersuchen.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• "Genetically encoded FRET probe for PKC activity based on pleckstrin." (2004) J. Am. Chem. Soc. 126, 11786-7
  Schleifenbaum A., Stier G., Gasch A., Sattler M., and Schultz C.
  
• "Extending the size of protein-RNA complexes studied by nuclear magnetic resonance spectroscopy." (2005) Chembiochem 6, 1578-84
  Mackereth C.D., Simon B., and Sattler M.
  
• "Structure and dynamics of the human pleckstrin DEP domain: distinct molecular features of a novel DEP domain subfamily." (2005) Proteins 58, 354-66
  Civera C., Simon B., Stier G., Sattler M., and Macias M.J.
  
• "Structure and phosphatidylinositol-(3,4)-bisphosphate binding of the C-terminal PH domain of human pleckstrin." (2005) Structure (Camb) 13, 277-86
  Edlich C., Stier G., Simon B., Sattler M., and Muhle-Goll C.
  
• A dual parameter FRET probe for measuring PKC and PKA activity in living cells. (2006) J. Am. Chem. Soc. 128, 24-5
  Brumbaugh J., Schleifenbaum A., Gasch A., Sattler M., and Schultz C.
  
• Determinants of conformational dimerization of Mad2 and its inhibition by p31comet. (2006) EMBO J. 25, 1273-84
  Mapelli M., Filipp F.V., Rancati G., Massimiliano L., Nezi L., Stier G., Hagan R.S., Confalonieri S., Piatti S., Sattler M., and Musacchio A.
  
• New NMR Assignment (1)H, (13)C, and (15)N Assignment of the Second PH Domain of Human Pleckstrin (234-350). (2006) J. Biomol. NMR
  Edlich C., Simon B., Sattler M., and Muhle-Goll C.
  
• Conformational plasticity of the lipid transfer protein SCP2. (2007) Biochemistry 46, 7980-91
  Filipp F.V. and Sattler M.
  
• Probing lipid- and drug-binding domains with fluorescent dyes. (2008) Bioorg Med Chem 16, 1162-1173
  Black S.L., Stanley W.A., Filipp F.V., Bhairo M., Verma A., Wichmann O., Sattler M., Wilmanns M., and Schultz C.
  
• Structure of the Eps15-stonin2 complex provides a molecular explanation for EH-domain ligand specificity. (2008) EMBO J 27, 558-69
  Rumpf J, Simon B, Jung N, Maritzen T, Haucke V, Sattler M, and Groemping Y