Die Rolle von Toll-Like-Receptors bei der Aktivierung und Regulation von antimikrobiellen Proteinen am Beispiel des murinen Bactericidal Permeability/Increasing Protein
Final Report Abstract
Wir haben im Zeitrahmen der Förderung durch die Gremien der DFG das Maus-Homolog des humanen antimikrobiellen Proteins bactericidal / permeability - increasing protien (BPI) identifiziert. Bis zu diesem Zeitpunkt galten Mäuse als natürlich defizient für dieses Protein. Zum Nachweis und zur Analyse der Regulation von murinem BPI haben wir verschiedene Reaganzien und Methoden etabliert. So haben wir eine Echt-Zeit-PCR zum Nachweis von Maus-BPI entwickelt, mit der wir die Regulation dieses Gens untersuchen können. Darüber hinaus haben wir ein anti-Maus BPI Peptidantiserum generiert, welches Maus-BPI auf Proteinebene spezifisch nachweist. Zusätzlich haben wir ein Expressionssystem zur Herstellung von rekombinantem murinem BPI entwickelt. Mit diesen Reagenzien haben wir zuerst die Expression und Regulation von murinem BPI in hämatopoietischen Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass neben murinen neutrophilen Granulozyten überraschenderweise auch dendritische Zellen (DZ) BPI exprimieren. In diesen Zellen ist BPI durch die Stimulation mit bakteriellen Produkten aber vor allem mit dem Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid (LPS) aus der Zellwand von Gramnegativen Bakterien stark induzierbar. Die LPS-vermittelte Induktion der BPI-Expression ist abhängig vom Toll-like Rezeptor 4, der die Anwesenheit von Gramnegativen Bakterien den Immunzellen durch das Erkennen von LPS signalisiert. Mit dem hoch aufgereinigten rekombinaten murinen BPI (rmSPI) haben wir die biologische Funktion des Proteins getestet. Dabei zeigte sich, dass rmBPI spezifisch sowohl isoliertes LPS als auch den LPS-Komplex, der der äußeren Membran von intakten Gramnegativen Bakterien aufgelagert ist, neutralisiert. Dabei ist die Effizienz der Neutralisation äquivalent der von gereinigtem natürlichem humanem BPI. Darüber hinaus inhibierte Maus-BPI die LPS-induzierte Zellaktivierung von wachsenden Escherichia coli Bakterien unabhängig einer bakteriziden Wirkung. Generell zeigte murines BPI eine schwache antibakterielle Wirksamkeit gegen Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) im Vergleich zu humanem BPi. In einer weiteren Studie haben wir analysiert, welchen Effekt ausgereinigtes humanes BPI gegenüber P. aeruginosa-Bakterien, die von Patienten mit Mukoviszidose isoliert wurden, hat. Diese Bakterien wachsen in vitro mit einem mukoiden Phänotyp, was ein Hinweis auf die Biofilmproduktion dieser Bakterien darstellt. Die Potenz der Biofilmbildung in der Lunge der Mukoviszidose-Patienten resultiert in einer multiplen Resistenz dieser Bakterien gegenüber Antibiotika, die routinemäßig in der Therapie der Infektionen eingesetzt werden. Trotzdem war humanes BPI in der Lage, diese multiresistenten Bakterien sehr effektiv abzutöten. Die Expression von BPI konnten wir in Sputen von Mukoviszidose-Patienten nachweisen. Die Hauptproduzenten von BPI in der Lungenflüssigkeit dieser Patienten waren neutrophile Granulozyten. Zusammenfassend haben wir in der gewährten Förderperiode Maus-BPI identifziert und konnten zeigen, dass es neben neutrophilen Granulozyten auch in dendritischen Zellen exprimiert wird. Murines BPI neutralisiert LPS aus der Zellwand von Gramnegativen Bakterien, zeigt allerdings nur schwache direkte antibakterielle Wirksamkeit. Dahingegen wirkt humanes BPI selbst gegen P. aeruginosa-Isolate bakterizid, die sich durch vielfache Antibiotika-Reistenzen auszeichnen.
Publications
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