The role of sterols and lipids in membrane organisation (rafts) and transport activity
Final Report Abstract
Im Förderzeitraum wurden die folgenden Ergebnisse erzielt: 1. Die Plasmamembran der Hefezelle ist in mindestens 2 laterale Kompartimente aufgeteilt. Das eine lässt sich mit spezifischen GFP-Fusionsproteinen als aus 60 - 80 rundlichen Flecken von etwa 300 nm Durchmessern bestehend darstellen. Wir nennen es MCC, nach dem zuerst dort lokalisierten Protein, dem Arginin/H+ Symporter Can1 (Membrane Compartment of Can1). Das zweite nimmt quantitativ den Raum zwischen den MCC Flecken ein, beherbergt die Protonen ATPase Pma1 und wurde MCP benannt. 2. Daneben gibt es Proteine, die homogen über die gesamte Membranfläche verteilt sind, wie z. B. der Glucose-Facilitator, Hxt1, und die Generelle Aminosäure Permease, Gap1. 3. Bei den Kompartimenten MCC und MCP handelt es sich um stabile Einrichtungen, die über 30-60 Minuten ihre Position beibehalten. Wie FRAP Experimente zeigen, sind jedoch Proteine innerhalb des MCP frei beweglich, wie vom Singer/Nicolson Modell gefordert. Die hier beobachtete Membran Kompartmentierung entspricht somit nicht dem „Lipid Raft" Konzept, das für tierische Zellen aufgestellt wurde. Damit stimmt auch überein, dass bei der Hefe alle Plasmamembran Proteine, unabhängig von ihrer Lokalisation, sich mit 1% Triton bei 4°C nicht solubilisieren lassen und sich somit wie DRM-Proteine (Detergenz resistente Membran Proteine) verhalten, also allesamt der klassischen „Raft"-Definition tierischer Zellen entsprechen. 4. Insgesamt konnten wir zeigen, dass 9 Membran- und 12 cytosolische Proteine im MCC-Bereich kolokalisieren und dass Ergosterol in den Flecken ebenfalls konzentriert vorliegt. Dagegen halten sich die dynamischen Proteine des endocytotischen Apparates nie im MCC-Bereich auf. Deshalb postulierten wir, dass das MCC eine Art Schutzschild für den Abbau von Membranproteinen darstellt. Dies konnte für Can1 und Fur4, den Uracil-Transporter, bewiesen werden. 5. In einem Mutanten-Screen aller nicht-letalen Einzel-Gen-Deletionen von S. cerevisiae identifizierten wir 28 Gene, die für die Bildung des typischen MCC Musters notwendig sind. Deutlich überproportional waren dabei Gene des Lipdstoffwechsels und des Vesikeltransports vertreten. Die Mutationen Nce102∆ und Pil1∆ verhindern die Fleckenbildung völlig; die verschiedenen MCC-Proteine sind in diesen beiden Mutanten homogen in der Plasmamembran verteilt. 6. Die MCC-Proteine sind z. T. in ihrer Lokalisation vom Membranpotential ∆ψ abhängig. So verlassen alle Symporter bei Depolarisierung innerhalb von Sekunden den MCC-Bereich; der Vorgang ist reversibel. Andere Membranproteine, wie z. B. Sur7 oder Nce102, sind nicht von ∆ψ beeinflusst. Sie „garantieren" sozusagen die MCC Domäne, in die die ausgewanderten Proteine nach Repolarisierung des Membranpotentials wieder zurückwandern. 7. Das heterolog in Hefen exprimierte HUP1-Gen des Hexose-H+ Symporters aus Chlorella lokalisiert als GFP-Fusionsprotein ebenfalls in den MCC-Flecken.
Publications
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