Regulation des Rab7 Guaninnukleotid-Austauschfaktors bei der endolysosomalen Biogenese

• Antragsteller: Professor Dr. Daniel Kümmel; Dr. Lars Langemeyer; Professor Dr. Christian Ungermann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 534725166

Die Organellen des Endomembransystems strukturieren den sekretorischen und den endozytären Weg. Zu diesen Organellen gehören das endoplasmatische Retikulum oder die Golgi im sekretorischen Weg und die Endosomen und Lysosomen im endozytischen Weg. Der Transport von Proteinen erfordert die Bildung von Vesikeln an Donororganellen und deren Fusion an Zielorganellen. Bei der Knospung verformen Hüllproteine die Membranen, während die Fusion von lokalisierten Rab-GTPasen und ihren interagierenden Tethering-Faktoren wie HOPS und SNAREs als Fusionsmaschinen abhängt. Im endozytischen Weg fusionieren endozytische Vesikel mit frühen Endosomen, die zu späten Endosomen reifen, bevor sie mit dem Lysosom (der Vakuole in Hefe) fusionieren. Die frühen Endosomen tragen Rab5, das in den späten Endosomen durch Rab7 ersetzt wird. Der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) Mon1-Ccz1 (MC1) für die Lokalisierung von Rab7 in späten Endosomen und Lysosomen erforderlich. Seine Aktivität muss zeitlich und räumlich koordiniert werden, wenn frühe Endosomen zu späten Endosomen reifen. Zum jetzigen Zeitpunkt haben wir Bedingungen geschaffen, um die Rab5-abhängige MC1-Aktivität auf Membranen nachzuweisen und die Funktion des Proteinkomplexes in Hefe- und Drosophila-Zellen zu verfolgen. Es fehlt uns jedoch an mechanistischen Erkenntnissen über die genaue Regulierung der MC1-Aktivität sowie seine Orientierung und Funktion auf Membranen. Die vorgeschlagenen Experimente zielen darauf ab, diese Aspekte in drei verschiedenen Zielen zu untersuchen. In Aim 1 werden wir der Frage nachgehen, wie MC1 das membranassoziierte Rab7 erkennt. Wir gehen davon aus, dass Rab7 eine spezifische Oberfläche benutzt, um an MC1 zu binden, und dass diese wahrscheinlich reguliert wird. In Aim 2 werden wir untersuchen, wie die N-terminale Domäne von Mon1 und andere Stellen in MC1 durch Phosphorylierung reguliert werden. Die Entdeckung der Bedeutung dieser Stellen könnte Aufschluss darüber geben, wie MC1 inaktiv gehalten wird, bis Endosomen oder Autophagosomen bereit sind, Rab7 zu rekrutieren. Schließlich werden wir in Aim 3 untersuchen, wie MC1-Komplexe an Rab7 und seine Rekrutierer binden und auf Membranen ausgerichtet werden. Zu diesem Zweck werden MC1-Komplexe auf Nanodiscs oder kleinen Liposomen rekonstituiert, die die entsprechenden Interaktoren tragen, und die Struktur wird mittels Kryo-Elektronenmikroskopie gelöst. Die Bedeutung neuartiger Schnittstellen wird durch die Analyse mutierter Proteine untersucht. Diese Analysen werden ein detailliertes Bild der MC1-Funktion als regulierter GEF an der Schnittstelle zwischen endosomaler Reifung und lysosomaler Funktion liefern. Dazu werden die drei Gruppen ihr biochemisches, zellbiologisches und strukturelles Fachwissen über MC1-Komplexe und Rab GTPasen kombinieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen