Funktionelle Charakterisierung des Peptidtransporters VfPTR1 in Leguminosen in Relation zur Proteinakkumulation im Samen
Final Report Abstract
Samenproteingehalt, als wichtiges Ertrags- und Qualitätsmerkmal, ist abhängig vom verfügbaren Stickstoff in den Pflanzen. Aminosäuren stellen dabei die Langstreckentransportform für organischen Stickstoff dar. Ihre Verteilung innerhalb der Pflanze erfolgt über das Phloem. Kleine Peptide entstehen vor allem in Geweben und zu Zeitpunkten rascher Proteolyse, z. B. während Seneszenz oder Keimung, und werden von Peptidtransportern transportiert. Charakterisierung von N-Transportern in Erbse sollte helfen, diese Transportprozesse besser zu verstehen. Des Weiteren sollte der Transfer von organischem Stickstoff in sich entwickelnde Samen und dessen Regulation analysiert werden. Im Mittelpunkt stand die funktionelle Charakterisierung des Peptidtransporters VfPTR1 und der Aminosäurepermease VfAAP1 in Leguminosen in Relation zur Proteinakkumulation im Samen. Ausgehend einer VfPTR1 cDNA konnte mittels genome walking der PTR1-Promotor isoliert werden. Promotoraktivität konnte für das 1,8 kb große DNA-Fragment in mit pPTR1-GUS transient transformierten V. faba Protoplasten gezeigt werden. In transgenen Pflanzen, die mit pPTR1-GUS bzw. pPTR1-GFP transformiert wurden, konnte eine Expression entsprechender Reportergene in Leitgeweben, Epidermis- und Parenchymzellen von Wurzeln sowie in Wurzelhaaren nachgewiesen werden. Bei GUS-Färbungen zeigte sich Aktivität des PTR1-Promotors zusätzlich im Stängelparenchym. Während der Samenentwicklung, in mit pPTR1GFP transformierten Erbsen, konnte eine GFP-Fluoreszenz in der Epidermis sowie den Parenchymzellen der Kotyledonen detektiert werden. Zusätzlich wurde mittels Northern Blot Analysen an V. faba Keimlingen gezeigt, dass VfPTR1 stark in Wurzelspitzen, im Hypokotyl und den Kotyledonen exprimiert wird. Experimente zur intrazellulären Lokalisierung des VfPTR1-Proteins gaben zunächst Hinweise auf eine vakuoläre Lokalisierung, demonstriert anhand eines GFP-Fusionskonstruktes in Protoplasten. Da das VfPTR1/GFP Fusionsprotein in transformierten Hefen nicht mehr funktionell war, bestanden Zweifel an dieser Lokalisierung. Mit einem spezifisch gegen den N- und C-Terminus von VfPTR1 gerichteten Peptidantikörper konnte mittels Immunogoldmarkierung elektronenmikroskopisch eine spezifische Markierung der Plasmamembran gezeigt werden. Eine Expression von VfAAP1 und VfPTR1 unter Kontrolle des phloemspezifischen AtSUC2-Promotors in Erbse führt zu geringer Erhöhung von Samenspeicherproteingehaltes, die nur die Globulinfraktion betraf. Eine Erhöhung des Gesamt-N war nicht signifikant. Durch Kreuzung von suc-AAP Erbsenlinien mit einer LeB4-AAP Erbsenlinie konnten doppelt homozygote Pflanzen für VfAAP1 erzeugt werden, die AAP sowohl phloem- als auch samenspezifisch exprimierten. Kreuzungspflanzen zeigten höhere N- und Proteingehaltes in reifen Samen im Vergleich zum Wildtyp und der Elternlinie 5/8. Eine N- und Proteinerhöhung im Vergleich zu beiden Elternpflanzen (5/8 und 14/10) konnte nur in Samen von in Phytokammern gewachsenen Pflanzen gezeigt werden.
Publications
- (2007) Uptake and Allocation of Carbon and Nitrogen in Vicia narbonensis plants with Increased Seed Sink Strength Achieved by Seed-specific Expression of an Amino Acid Permease. (2007) J Exp Bot. 58,3183-3195
Götz, KP, Staroske, N, Radchuk, R, Emery, RJN, Wutzke, KD, Herzog, H, Weber, H
- (2008) Increasing amino acid supply in pea embryos reveals specific interactions of N and C metabolism and highlights the importance of mitochondrial metabolism. Plant J. 55, 909-926
Weigelt K, Küster H, Radchuk R, Müller M, Weichert H, Fait A, Fernie AR, Saalbach I, Weber H
