Function of pro-sequences in oxidative folding of cystin-knot-proteins
Final Report Abstract
Teilprojekt zur funktionellen Spezifität der Pro-Peptide: Um zu untersuchen, ob die Pro-Peptide von NGF und Neurotrophin-3 (NT-3) ohne Verlust ihrer faltungsfördernden Eigenschaften ausgetauscht werden können, wurden chimäre Proteine der reifen Teile von NGF und NT-3 mit heterologen Pro-Peptiden hergestellt. Die heterologen Pro-Peptide hatten keinen Einfluß auf die Struktur oder Stabilität der reifen Domänen. Auch die Stabilität der Pro-Peptid-Domänen war durch die hetrologen reifen Teile nicht reduziert. Für das chimäre Protein bestehend aus dem reifen Teil von NGF und dem Pro-Peptid von NT-3 konnte gezeigt werden, dass das heterologe Pro-Peptid die oxidative Faltung in ähnlichem Umfang stimuliert wie das endogene Pro-Peptid von NGF. Für die zweite Chimäre wurden indirekte Hinweise erhalten, dass auch hier das heterologe Pro-Peptid von NGF die oxidative Faltung des reifen Teils von NT-3 stimuliert. Teilprojekt zur Widerlegung der loop Mreadmg-Hypothese: Die loop threading-Hypothese postuliert, dass die langsame Entfaltung von NGF durch ein sehr langsames Zurückfädeln des N-Terminus von NGF durch den Cystinknoten verursacht wird. Anhand von proNGF mit der um 103 Aminosäuren verlängerten N-terminalen Pro- Peptid-Domäne sollte diese Hypothese getestet werden. Allerdings war die Kinetik der langsamen Entfaltung von proNGF vergleichbar mit der von reifem NGF. Dies ist bei einem Zurückfädeln des um 103 Aminosäuren verlängerten Pro-Peptids nicht zu erwarten. NMRAnalysen der Spezies, die den langsamen Entfaltungsschritt noch nicht durchlaufen hat, implizieren Reststrukturen. Da die Reduktion dieser Reststrukturen sehr viel langsamer war als die Reduktion des vollkommen entfalteten Proteins, ist anzunehmen, dass die Strukturen im Bereich des Cystinknotens liegen, dessen Struktur sich erst nach sehr langer Inkubation unter denaturierenden Bedingungen auflöst. Ein weiterer Befund spricht gegen das loop threading: die vollkommen entfaltete Spezies kann zur native Struktur zurückfalten, diese Beobachtung ist mit einem loop threading nicht vereinbar, weil ein korrektes Einfädeln des Pro-Peptids in den Cystinknoten und ein Zurückziehen durch den Cystinknoten extrem unwahrscheinlich ist. Teilprojekt zur Strukturbildung des Pro-Peptids in proNGF: Da keine Strukturdaten zur Assoziation des Pro-Peptids mit dem reifen Teil von NGF zur Verfügung stehen, wurde die Wechselwirkung des Pro-Peptids mit dem reifen Teil durch Deund Renaturierungsstudien verfolgt. Dabei wurden Hinweise für mindestens zwei kinetische Intermediate erhalten. Insgesamt wird die Wechselwirkung des Pro-Peptids mit dem reifen Teil durch AG = 20,9 kJ/mol stabilisiert. Ein Oberflächenbereich in Nachbarschaft zu Tryptophan 21 im reifen Teil stellt wahrscheinlich die Kontaktfläche zum Pro-Peptid her. Mit diesen Ergebnissen kann die im Vergleich zur reifen Form reduzierte Bindung der Pro-Form an den Rezeptor TrkA erklärt werden, da Co-Kristallisationsdaten einer anderen Arbeitsgruppe auf eine Beteiligung des Tryptophanrestes bei der Rezeptorbindung hindeuten. Dabei konkurrieren wahrscheinlich Rezeptor und Pro-Peptid um überlappende Oberflächenbereiche im reifen Teil. Das mit dem reifen Teil wechselwirkende peptidische Fragment im Pro-Peptid wurde identifiziert.
Publications
- Kliemannel, M., Weininger, U., Baibach, J., Schwarz, E. and Rudolph, R. (2006). Examination of the slow unfolding of proNGF argues against a loop-threading of NGF. Biochem. 45, 3517-3524.
- Paoletti, F., Konarev, P. V., Covaceuszach, S., Schwarz, E., Cattaneo, A., Lamba, D. and Svergun, D. I. (2006). Structural and functional properties of mouse proNGF. Bio. Soc. Trans. 34, 605-606.
- Hauburger, A., Kliemannel, M., Madsen, P., Rudolph, R. and Schwarz, E. (2007). Oxidative folding of nerve growth factor can be mediated by the pro-peptide of neurotrophin-3. FEBS Letters, 581, 4159-4164.
- Kliemannel, M., Golbik, R., Rudolph, R., Schwarz, E. and Lilie, H. (2007). The pro-peptide of proNGF: structure formation and intramolecular association with NGF. Prot Sei. 16, 411-419.
