Ribonuklease P - Untersuchungen zum Spaltmechanismus, zur Substrat- und Produkt-Bindung sowie zur Identifizierung und Charakterisierung wichtiger funktioneller Gruppen der katalytischen RNA-Untereinheit bakterieller Enzyme
Final Report Abstract
Im Rahmen einer Zusammenarbeit mit der Gruppe von Eric Westhof (Strasbourg) haben wir die differenzielle Rolle der drei Interdomänen-Kontakte in verschiedenen bakteriellen P RNAs des Strukturtyps A herausgearbeitet. UV-Schmelzkurven zeigen, dass die C- und S-Domänen infolge der Ausschaltung der L8-P4- und L18-P8-Kontakte stabiler gefaltet sind als wenn sie über die Interdomänenkontakte miteinander assoziiert sind, d.h. die eine Domäne verhält sich zur jeweils anderen Domäne wie ein folding chaperone mit negativer Kooperativität. In Zusammenarbeit mit Christian Spahn (HU Berlin) sollten bakterielle P RNAs auf der Oberfläche ribosomaler E. coli 50S-Partikel präsentiert und dann mittels Kryoelektronenmikroskopie strukturell charakterisiert werden. Da die E. coli-Zellen solche Insertionen effizient aus der 23S rRNA entfernen, konnte dieser Ansatz bisher nicht zum Erfolg geführt werden. In einem kryoelektronenmikroskopischen Backup-Projekt gelang es uns dann, neue mechanistische Erkenntnisse zur Translokation des Ribosoms zu gewinnen. Die bisher molekular nicht identifizierte RNase P von A. aeolicus unterscheidet sich in ihrer Architektur grundsätzlich von der anderer Bakterien und stellt das letzte große Geheimnis im RNase P-Feld dar. Wir sind der Lüftung dieses Geheimnisses ein gutes Stück näher gekommen, indem wir ein robustes Reinigungsprotokoll entwickelt haben und eindeutige Evidenzen liefern konnten, dass das Enzym eine RNA-Komponente besitzt. Bezüglich der archaealen RNase P arbeiten wir daran, Mutantenstämme von H. volcanii und M. mazei zu konstruieren, die chromosomal getaggte RNase P-Komponenten exprimieren, um so Interaktionspartner archaealer RNase P-Enzyme kopurifizieren und identifizieren zu können, bzw. um die angereicherten RNase P-Enzyme biochemisch zu charakterisieren. Die RNA (H1 RNA) der humanen Kern-lokalisierten RNase P besitzt nur eine marginale Ribozymaktivität in Abwesenheit ihrer 10 Proteinkomponenten. Es gelang uns, die Ribozymaktivität durch Einführung lokaler struktureller Änderungen, die aus bakteriellen P RNA-Konsensusstrukturen abgeleitet wurden, leicht zu verbessern. Wir konnten zudem zeigen, dass die H1 RNA durch bakterielle P Proteine in ihrer Aktivität stimulierbar ist. Zusammenfassend ziehen wir jedoch den Schluss, dass die “nackte” H1 RNA im Laufe der Evolution die Fähigkeit eingebüßt hat, eine stabile und funktionelle RNA-Architektur mit hochhaffinen Mg2+-Bindungsstellen auszubilden. Wir haben den Spaltmechanismus der bakteriellen RNase P anhand von singulären LNA-Modifikation an der RNase P-Spaltstelle charakterisiert. Die Ergebnisse sind die ersten Beispiele für die Verwendung von “LNA als Tool” zum Studium von Ribozym-katalysierten Reaktionen. Dithioat-Modifikationen an der Spaltstelle (Rp- oder Sp-Phosphorothioat + 3’-S-Phosphorothiolat) haben wir eingesetzt, um thiophilen Metallionen (Mn2+, Zn2+, Cd2+) eine verbesserte “Interaktionsfläche” zu präsentieren und so Hinweise auf direkte Metallionenbindungen an den pro-Sp- und/oder 3’-Brücken-Sauerstoff zu erhalten. Eine Kurierung der Prozessierung Dithioat-modifizierter Substrate in Gegenwart thiophiler Metallionen konnte jedoch nicht beobachtet werden. Gegenwärtig verfolgen wir das Ziel, mittels NMR-Spektroskopie herauszufinden, an welchen Stellen im Substrat in der Nähe der Spaltstelle Metallionen neu gebunden bzw. umorientiert werden, wenn das RNA-Substrat mit der katalytischen RNA und der Proteinkomponente einen spezifischen Komplex bildet. Hier befinden wir uns nach wie vor in der Phase der Herstellung geeigneter RNA-Komponenten. FRET-Einzelmolekülmessungen mit Fluorophor-markierten Vorläufer-tRNAs waren geplant, um konformative Änderungen des tRNA-Körpers im Verlauf des RNase P-Reaktionszyklus zu identifizieren Die RNase P-Prozessierung der doppelt bzw. dreifach Fluorophor-markierten tRNAs war jedoch stark verlangsamt, und die markierten tRNAs zeigten erhebliche Löslichkeitsprobleme, die den hydrophoben Fluorophoren zugeschrieben werden können. Das B. subtilis proB-Gen, das ein Enzym der Prolinbiosynthese kodiert und einer Expressionsregulation durch T-Box-abhängige transkriptionelle Antitermination unterliegt, wurde als Modellsystem für ein Nicht-tRNA-Substrat der RNase P von B. subtilis untersucht. Während eine RNase P-Prozessierung im 5’-UTR von proB in vitro dokumentierbar war, konnte der Beweis einer physiologischen Relevanz dieser Prozessierung auf der Basis von lacZ-Fusionen nicht geführt werden. In einem Kooperationsprojekt mit der AG von M. Keusgen wurde eine magnetische Biosensor-Methode zur Quantifizierung von RNA-Protein-Interaktionen entwickelt. In einer Zusammenarbeit mit der Gruppe von J. Kjems (Aarhus, DK) im Bereich modifizierter RNA-Aptamere haben wir spezielle Protokolle für die enzymatische Aptamersynthese zur Anwendung gebracht, die im Rahmen des Projekts entwickelt wurden.
Publications
- (2008). Escherichia coli RNase P RNA: substrate ribose modifications at G+1, but not nucleotide -1/+73 base pairing, affect the transition state for cleavage chemistry. J. Mol. Biol. 379, 1-8
Cuzic S, Heidemann KA, Wöhnert J, Hartmann RK
- (2008). In: “Nucleic Acids from A to Z. A Concise Encyclopedia”, S. Müller (Ed.)., pp. 125-127, 130-132, 135-136, 240-242, 327-328; Wiley-VCH, Weinheim, Germany
Hartmann RK, Mörl M, Willkomm DK
- (2008). The putative RNase P motif in the DEAD box helicase Hera is dispensable for efficient interaction with RNA and helicase activity. Nucleic Acids Res. 36, 5800-5811
Linden MH, Hartmann RK, Klostermeier D
- (2009). Investigation of catalysis by bacterial RNase P via LNA and other modifications at the scissile phosphodiester. Nucleic Acids Res. 37, 7638-7653
Cuzic-Feltens S, Weber MH, Hartmann RK
- (2009). RNase P as a drug target. In: Ribonuclease P (eds. FY Liu, S Altman), Springer, New York, Chapter 13, pp. 235-256. ISBN 978-1- 4419-1141-4
Willkomm DK, Pfeffer P, Reuter K, Klebe G, Hartmann RK
- (2009). The making of tRNAs and more - RNase P and tRNase Z. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 85, 319-368
Hartmann RK, Gößringer M, Späth B, Fischer S, Marchfelder A
- (2010). Analysis of bacterial RNase P RNA and protein interaction by a magnetic biosensor technique. Biochimie 92, 772-778
Li D, Meyer MH, Willkomm DK, Keusgen M, Hartmann RK
- (2010). Head swivel on the ribosome facilitates translocation by means of intra-subunit tRNA hybrid sites.Nature 468, 713-716
Ratje AH, Loerke J, Mikolajka A, Brünner M, Hildebrand PW, Starosta AL, Dönhöfer A, Connell SR, Fucini P, Mielke T, Whitford PC, Onuchic JN, Yu Y, Sanbonmatsu KY, Hartmann RK, Penczek PA, Wilson DN, Spahn CM
- (2010). Serum-stable RNA aptamers to urokinase-type plasminogen activator blocking receptor binding. RNA 16, 2360-2369
Dupont DM, Madsen JB, Hartmann RK, Tavitian B, Ducongé F, Kjems J, Andreasen PA
- (2012). Characterization of RNase P RNA Activity. Methods Mol. Biol. 848, 61-72
Gößringer M, Helmecke D, Hartmann RK
