Optimierung eines für Chenopodium quinoe und Beta vulgaris geeigneten viralen Expressionssystems

• Applicant: Dr. Wolfgang Burgermeister
• Subject Area: Plant Breeding and Plant Pathology
• Term: from 2000 to 2009
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5237952

• Final Report Year: 2009

Final Report Abstract

Für pflanzenvirale Expressionsvektoren gibt es die verschiedensten Anwendungsmöglichkeiten. Besonders interessant ist die Produktion von wirtschaftlich wichtigen Proteinen wie Impfstoffen, Antikörpern, Enzymen, (die gegebenenfalls durch Veränderungen in ihren kodierenden Sequenzen für bestimmte Anwendungen optimiert werden können), anti-Tumor-Agentien etc. in Pflanzen. Über das virus-inducedgenesilencing (VIGS) ermöglichen pflanzenvirale Expressionsvektoren weiterhin eine Funktionsanalyse von Pflanzen-Genen. Schließlich scheinen Vorhersagen über die Hemmbarkeit von Virusinfektionen durch Expression viraler Genombereiche durch derartige virale Vektoren möglich (Culver, 1996; Bleykasten-Grosshans et al., 1997; Dolja et al., 1997). Die meisten pflanzenviralen Vektoren sind vor allem für Solanaceaen, insbes. Nicotiana benthamina, geeignet. Unser Bestreben war es, ein virales Expressionssystem für die bei Pflanzenvirologen besonders beliebte Testpflanze Chenopodium quinoa und für Zuckerrüben zu entwickeln. Mit einem solchen System sollte der Einfluss exprimierter Nukleinsäuresequenzen auf Replikation und Translokation des Rhizomaniavirus (Beet necrotic yellow vein virus, BNYW) und des Soil-borne cereal moaic virus (SBCMV) getestet werden. Als Grundlage für ein zu entwickelndes Vektorsystem schienen die verschiedenen, ursprünglich als Stämme bezeichneten Isolate des zur Gattung Potexvirus gehörenden Cactus virus X besonders geeignet. Die Sequenzierung ihrer genomischen RNAs ergab - wie früher schon serologische Untersuchungen - , dass die aus Zygocactus sp.; Schlumbergera sp. und Opuntia sp. stammenden Isolate nur relativ entfernt verwandt sind. Sie werden daher auf unseren Vorschlag vom ICTV jetzt als drei eigenständige Viren, nämlich Zygocactus virus X (ZVX), Schlumbergera virus X (SVX) und Opuntia virus X (OVX) geführt. Mit einem auf dem ZVX basierenden Vektor ist es uns gelungen, das BNYW- und das SBCMV-Hüllprotein in C. quinoa, Tetragonia expansa und Zuckerrüben zu exprimieren. Dabei konnten wir erstmalig nachweisen, dass das BNYW-Hüllprotein alleine - auch ohne sein Durchleseprotein - zu BNYW-ähnlichen Partikeln aggregieren kann. Leider führten die auf dem ZVX oder dem SVX basierenden Konstrukte - im Gegensatz zu den Wild-Typ Isolaten - nur in seltenen Fällen zu systemischen Infektionen. Unser Endziel, nämlich die Entwicklung eines Systems zur Testung des Einflusses von exprimierten Nukleinsequenzen auf die Replikation und Translokation des BNYW und des SBCMV, konnten wir daher nicht erreichen. Um die von uns entwickelten Konstrukte auch für weitere Anwendungen nutzbar zu machen, haben wir Kontakt mit Prof. Y. Gleba (Icon-Genetics, Biozentrum Halle) aufgenommen. Prot Gleba und seine Mitarbeiter konnten mit einer von ihnen entwickelten 'deconstructed virus' Strategie eine 10hoch7 fache Steigerung der Effizienz eines auf einem Tobamovirus basierenden Konstruktes erzielen. Dabei wurde die Funktion der systemischen Ausbreitung durch eine besonders effiziente Form der Agroinfektion (Magnifection) ersetzt und die der Hüllprotein- Bildung; die den Syntheseapparat der Pflanze unnötig belastet, eliminiert. Die Einführung von Introns und die Eliminierung von kryptischen splicing sites trugen weiterhin zur Verbesserung der Konstrukte bei. Prof. Gleba hat sich bereit erklärt, Forschungsarbeiten zur Optimierung unserer Konstrukte durchzuführen, wobei eventuell erzielte Ergebnisse veröffentlicht werden sollen. Über die DMSZ stehen die Konstrukte auch anderen interessierten Kollegen zur Verfügung.

Publications

• Koenig, R., and Lesemann, D.-E. Ein Tymovirus aus den Zierpflanzen Diascia und Nemesia-wie zuverlässig ist die Serologie bei der Identifizierung von Pflanzenviren? Phytomedizin 30/2: 16-17, (2000)
  
  
• Koenig, R., Bergstrom, G.C, and Loss, S. A new wheat-infecting furovirus which is rapidly spreading in the North-Eastern USA differs considerably from Soil-borne wheat mosaic virus in the nucleotide sequences of various genes, but not in the deduced amino acid sequences of the corresponding gene products. 5th Symposium International Working Group of Plant Viruses with Fungal Vectors. Zurich 22. 7. -25. 7. 2002.
  
  
• Koenig,,R., Bergstrom, G.C, Gray, S.M., and Loss, S. A new wheat-infecting : Furovirus which is rapidly spreading in the North-Eastem U.S.A. differs considerably from the type strain of Soilborne wheat mosaic virus in the nucleotide sequences of various genes, but not in the deduced amino acid sequences of the corresponding gene products. Proceedings of the Fifth Symposium of the International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors, Zurich, July 22-25, 2002. C. M. Rush and U. Merz, eds. 1-4, (2003)
  
  
• Koenig, R., Lesemann, D.E., Engelmann, J., Loss, S, Schiemann, J., and Bürgermeister, W. Formation of virus-like particles from beet necrotic yellow vein virus coat protein expressed by a cactus potexvirus-based vector construct. Proceedings of the Sixth Symposium ofthe International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors, Bologna - Italy, September 5-7, 2005, ISBN 1-4243- ,0215-3. pp. 30-33
  
  
• Barends, S., Koenig, R., Gultyaev, A.P., Lesemann, D.-E., Vetten, H.J., Loss, S., and Pleij, C.W.A. NeRNV, a.new tymovirus with a genomic RNA having a histidylatable tobamovirus-like 3'end. Fourth Joint Meeting of Dutch and Genman. Plant Virologists, Wageningen, March 10 and 11, 2005 p. 16 (2005) und Phytomedizin 35 (3), 23-24 (2005).
  
  
• Harr, U. Untersuchungen zur Eignung viraler Vollängenklone zur Expression von Nukleinsäuresequenzen mit möglichem antiviralem Potenttal in Pflanzen. Dissertation Technische Universität Braunschweig, 2002
  
  
• Harr, U., Koenig, R., Lesemann, D.-E., and Santa Cruz, S. Expression of native and modified genes in plants from infectious viral cDNA clones. Phytomedizin 31: 33-34, 2001
  
  
• Huth, W., Lesemann, D.E., und Koenig, R. Erstmaliger Nächweis eines bodenbürtigen Virus in einem Weizenschlag in Deutschland. Phytomedizin 33/2: 29- 30 (2003)
  
  
• Koenig, R. Bergstrom, G.C. Gray, S.M., and Loss, S. A New York isolate of Soilborne Wheat Mosaic Virus differs considerably from the Nebraska type strain in the nucleotide sequences of various coding regions but not in the deduced amino acid sequences. Archives of Virology 147: 617-625 (2002)
  
  
• Koenig, R., and Huth, W. Natural infection of wheat by the type strain of Soil-Borne Wheat Mosaic Virus In a field in Southern Germany. European Journal of Plant Pamo/ogfy 109: 191-193(2003)
  
  
• Koenig, R., and Loss, S. Ein PCR-System mit Zufallsprimern und drei spezifischen Primern zur Analyse von unbekannten Genombereichen, die sich an bereits sequenzierte anschliessen. Phytomedizin 32/2: 26 (2002)
  
  
• Koenig, R., Bergstrom, G.C, and Loss, S. Herkünfte des Soil-borne wheat mosaic . virus aus verschiedenen geographischen Regionen zeigen beträchtliche Unterschiede in der Nukleotidsequenz verschiedener Gene, aber nicht in der Aminosäuresequenz der entsprechenden Genprodukte. Phytomedizin 32/2: 21, 2002
  
  
• Koenig, R., Lesemann, D.-E., Loss, S., and Bürgermeister, W. Formation of virus-like particles from Beet necrotic yellow vein virus coat protein expressed by a Cactus potexvirus-based vector construct. Sixth Symposium of the International Working Group on Plant Viruses with'Fungal Vectors, Bologna - Italy, September 5-7, 2005, Book of Abstracts, p 21
  
  
• Koenig, R., Lesemann, D.E., Loss, S., Engelmann, J., Commandeur, U., Demi, G. Schiemann, J., Aust, H. and Bürgermeister W. Zygocactus virus X-based expression vectors and formation of rod-shaped virus-like particles in plants by the expressed coat proteins of Beet necrotic yellow vein virus and Soil-borne cereal mosaic virus. Journal of General Virology 87: 439 - 443, 2006.
  
  
• Koenig, R., Loss, S.. and Lesemann, D.E. BNYW-like particles formed from coat protein expressed by a potexvirus-based vector construct. Fourth Joint Meeting of Dutch and German Plant Virologists, Wageningen, March 10 and 11, 2005, p. 7 und Phytomedizin 35 (3), 10-11 (2005).
  
  
• Koenig, R., Pleij, C.W.A., Loss, S., Burgermeister, W., Aust, H., and Schiemann, J. Molecular characterisation of potexviruses isolated from three different genera in the family Cactaceae. Archives of Virology 149: 903-907 (2004)
  
  
• Koenig, R., und Huth, W. In Deutschland kommt nicht nur das weit verbreitete Soilborne cereal mosaic furovirus vor; sondern in einem bisher begrenzten Areal auch das aus Amerika lange bekannte Soil-borne wheat mosaic furovirus. Phytomedizin 33/2: 28-29 (2003)
  
  
• Koenig, R., Verhoeven, J.Th.J., Pleij, C.W.A., and Lesemann, D.-E. Dutch-German cooperations in evaluating species demarcation criteria for tombus- and tymoviruses. Fourth Joint Meeting of Dutch and German Plant Virologists, Wageningen, March 10 and 11, 2005, p.25 (2005) und Phytomedizin 35 (3), 38-39 (2005)