Project Details
Projekt
The role of PKC Isotypes in cell adhesion, spreading an migration
Applicant
Dr. Wolfgang Helmut Ziegler
Subject Area
Cell Biology
Term
from 2002 to 2006
Project identifier
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5469361
In animals, formation of cell-matrix contacts is essential for embryogenesis and wound healing. Assembly and dynamics of such structures can be studied in tissue culture, and a large number of proteins have been found localized at the cytoplasmic face of these contact sites, where they are assumed to link microfilament ends to the plasma membrane. However, little is known on the regulation of cell-matrix adhesion sites, i.e. their assembly, maturation and disassembly in reaction to extra- and intracellular signals. In the project presented here, we would like to study the role of protein kinase C (PKC) in these events. Preliminary data describe the interactions of several isotypes of this kinase family with actin, vinculin and talin which are all essential components of cell-matrix contacts. We propose to study these interactions in detail and to expand these studies to other cell contact proteins. We will follow translocation of PKC isotypes during cell adhesion, spreading and migration. Colocalization of PKC with the contact proteins by immunofluorescence and by CLS microscopy of GFP-construct transfected cells will be combined with biochemical studies, using isolated recombinant proteins, cell fractionation, membrane-permeant crosslinkers and immuno-precipitation. Inhibitor and activator studies will reveal information on the role of PKC activity and PKC-dependent phosphorylation of contact proteins in these processes. Während der Embryogenese und der Wundheilung ist die Ausbildung von Kontakten zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix ein Prozess von grundlegender Bedeutung. Aufbau und Dynamik solcher Kontakte, die morphologisch diskrete Strukturen darstellen, können in der Zellkultur untersucht werden. Auf der zytoplasmatischen Seite der vollständig ausgebildeten (reifen) Zell-Matrix-Kontakstellen stationärer Zellen wurde eine eindrucksvolle Zahl von Proteinen lokalisiert, die in vitro untereinander und mit Mikrofilamenten wechselwirken. Es wird daher angenommen, daß diese Proteine die membrannahen Enden der Mikrofilamente in Suprastrukturen organisieren, welche dann mit den Transmembran-Proteinen der Integrin-Familie verknüpft werden. Die Kinetik solcher Interaktionen, die Hierarchie der Komponenten sowie die Steuerung der Kontaktausbildung durch extra- und intrazelluläre Signale sind noch weitgehend unbekannt. Bei der Regulation dieser Vorgänge wird jedoch Proteinphosphorylierungs-Prozessen durch Kinasen wie der Proteinkinase C und der "focal adhesion kinase" eine große Bedeutung beigemessen.
Im vorliegenden Projekt möchten wir die Ausbildung des Proteinkomplexes und die Interaktionen zwischen Proteinen des Mikrofilament-Systems in Zell-Matrix-Kontakte studieren. Dazu beabsichtigen wir insbesondere, die Rolle der Proteinkinase C (PKC) während der Bildung und Reifung solcher Kontakte im Verlauf der Adhäsion, Ausbreitung und Migration von Zellen zu untersuchen. Vorläufige Daten deuten auf Wechselwirkungen verschiedener Isoformen der PKC-Familie mit Aktin, Viculin und Talin, also essentiellen Bestandteilen der Zell-Matrix-Kontakte, hin. Wir planen, diese Interaktionen im Detail zu charakterisieren und auf andere Zell-Matrix-Kontakten während der Zelladhäsion, -ausbreitung und Lokomotion. Die Kolokalisation der PKC mit Proteinen der Zell-Matrix-Kontakte soll anhand von Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie (CLSM) über GFP-markierte Konstrukte in transfizierten Zellen untersucht werden sowie mittels biochemischer Studien, in denen Zellfraktionierung, membrangängige "crosslinker" und Immunpräzipitation zum Einsatz kommen. Weiterhin sollen Inhibitoren und Aktivatoren der PKC verwendet werden, um die Rolle der PKC Aktivität und der PKC-abhängigen Phosphorylierung von Kontakt-Proteinen in diesen Prozessen untersuchen.
Im vorliegenden Projekt möchten wir die Ausbildung des Proteinkomplexes und die Interaktionen zwischen Proteinen des Mikrofilament-Systems in Zell-Matrix-Kontakte studieren. Dazu beabsichtigen wir insbesondere, die Rolle der Proteinkinase C (PKC) während der Bildung und Reifung solcher Kontakte im Verlauf der Adhäsion, Ausbreitung und Migration von Zellen zu untersuchen. Vorläufige Daten deuten auf Wechselwirkungen verschiedener Isoformen der PKC-Familie mit Aktin, Viculin und Talin, also essentiellen Bestandteilen der Zell-Matrix-Kontakte, hin. Wir planen, diese Interaktionen im Detail zu charakterisieren und auf andere Zell-Matrix-Kontakten während der Zelladhäsion, -ausbreitung und Lokomotion. Die Kolokalisation der PKC mit Proteinen der Zell-Matrix-Kontakte soll anhand von Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie (CLSM) über GFP-markierte Konstrukte in transfizierten Zellen untersucht werden sowie mittels biochemischer Studien, in denen Zellfraktionierung, membrangängige "crosslinker" und Immunpräzipitation zum Einsatz kommen. Weiterhin sollen Inhibitoren und Aktivatoren der PKC verwendet werden, um die Rolle der PKC Aktivität und der PKC-abhängigen Phosphorylierung von Kontakt-Proteinen in diesen Prozessen untersuchen.
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