Metabolische Prozessanalyse im Zulaufverfahren
Final Report Abstract
Biotechnologische Produktionsprozesse werden überwiegend im Zulaufverfahren durchgeführt. Hierbei werden verschiedene Prozessphasen durchlaufen. Je nach Prozessphase kommt es zu starken physiologischen Veränderungen der Mikroorganismen (Fluxom, Proteom, Metabolom). In den meisten Fällen ist es nur annähernd möglich, diese Prozesszustände im Chemostaten zu realisieren, der üblicherweise zur Identifikation der intrazellulären Stoffflussverteilungen oder von (dynamischen) Stoffwechselmodellen benutzt wird. Damit sind industrielle Zulaufverfahren bis heute einer metabolischen Analyse nur begrenzt zugänglich. Zielsetzung war daher die Entwicklung neuer experimenteller Methoden, die es ermöglichen, Zellen aus einem laufenden Zulaufverfahren in kurzer Zeit auf metabolischer Ebene zu analysieren (Metabolom, Fluxom). In sequentiellen Kurzzeitexperimenten parallel zum Produktionsprozess sollten damit Datensätze gewonnen werden, die mit einem neuen theoretischen Ansatz direkt zur Bestimmung der Kontrollstruktur des metabolischen Netzwerkes unter Produktionsbedingungen ausgewertet werden sollten. Zusätzliche Proteomanalysen sollten helfen, Effekte auf genetischer Ebene abzugrenzen. Diese Methodenentwicklung sollte am Beispiel von Escherichia coli erfolgen. Zur metabolischen Analyse von Zellen aus einem Produktionsprozess wurden zum gewünschten Prozesszeitpunkt Zellen aus dem Produktionsreaktor entnommen und unmittelbar in einem kontrollierten Labor-Rührkesselreaktor veränderten Reaktionsbedingungen ausgesetzt (rapid media transition). Die in diesem Analysenreaktor jeweils individuell vorgelegten Substrate wie beispielsweise Glukose, Pyruvat, Succinat und Acetat wurden von den suspendierten E. coli Zellen direkt verstoffwechselt. Auf der Basis der innerhalb von 15 – 18 Minuten gemessenen extrazellulären Stoffflüsse konnten stationäre Stoffflussanalysen und nach schneller Probenahme und LC-MS Analyse intrazelluläre Metabolomanalysen durchgeführt werden. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Proteom der zu untersuchenden Zellen aufgrund der Kurzzeitexperimente nicht veränderte. Dadurch sind Einblicke in die Regulation des Stoffwechsels unter realen Prozessbedingungen möglich. Durch Kombination stochastischer Methoden der Metabolischen Kontrollanalyse und thermodynamische Analysen konnten die Kontrollparameter des Zentralstoffwechsels von Escherichia coli bestimmt werden. Hinsichtlich der biologischen Fragestellung konnte gezeigt werden, welche Rolle metabolische Homeostase hat, da sehr große Änderungen der Stoffflüsse durch oft nur kleine Änderungen der Metabolitkonzentrationen erreicht wurden. Weiter konnte gezeigt werden, dass nicht die Glukoseaufnahme die Stoffflüsse in der Glykolyse von Escherichia coli kontrolliert (was in der Literatur kontrovers beschrieben wird), sondern der Energiebedarf der Mikroorganismen in Form von ATP.
Publications
- 2007, ‘Steady state analysis of metabolic pathways: comparing the double modulation method and the lin-log approach’, Metabolic Engineering, vol. 9, no. 5-6, pp. 433-441
Link, H., Weuster-Botz, D.
- 2008, ‘Leakage of adenylates during cold methanol/ glycerol quenching of Escherichia coli ’, Metabolomics, vol. 4, no. 3, pp. 240-247
Link, H., Anselment, B., Weuster-Botz, D.
- 2009, ‘Rapid media transition for metabolic control analysis of fedbatch fermentation processes’, Dissertation Technische Universität München
Link, H.
- 2009, ‘Rapid media transition: An experimental approach for steady state analysis of metabolic pathways’, Biotechnology Progress
Link, H., Anselment, B., Weuster-Botz, D.
(See online at https://doi.org/10.1002/btpr.290)
