Entwicklung einer online-Messtechnik in Mikrotiterplatten für rekombinante Proteine mit kurzen Tags
Final Report Abstract
Die immer schnellere Generierung neuer Zielproteine durch die molekulare Biotechnologie hat zu einem riesigen Bedarf an effizienten und hochdurchsatzfähigen Screening-Verfahren geführt. Mikrotiterplatten (MTPs) stellen in diesem Zusammenhang einen hervorragenden parallelen Mikrobioreaktorarray zur Kultivierung von Mikroorganismen dar. Unter definierten verfahrenstechnischen Bedingungen ist eine Charakterisierung von Mikroreaktorsystemen für ein Scale-up im Labormaßstab möglich. Um die Effizienz dieser Systeme auszuschöpfen und rationale Entscheidungen aus verschiedenen parallelen Experimenten abzuleiten, sind online erfassbare Daten über den Kultivierungszustand von entscheidender Wichtigkeit. Als Ausgangspunkt für dieses Forschungsvorhaben diente die am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik entwickelte Technologie zur optischen, nicht invasiven online-Verfolgung von kontinuierlich geschüttelten mikrobiellen Kulturen in MTPs. Diese Technologie ermöglicht sowohl die Erfassung des Biomassewachstums als auch die Bildung eines fluoreszenzbasierten Wertproduktes. Häufig ist das Wertprodukt mit GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) oder deren Derivaten fusioniert. Die Fusion eines Zielproteins mit GFP ist allerdings oft problematisch. In diesem Projekt sollte deshalb ein neues, sehr kleines und durch optisch aktives Peptid-Tag als GFP-Ersatz entwickelt werden, welches die Eigenfluoreszenz der Aminosäure Tryptophan (W) ausnutzt. Dieses Peptid-Tag, im Folgendem als W-tag bezeichnet, besteht im Grundgerüst aus einer natürlich vorkommenden Proteinschleife, die eine unterschiedliche Anzahl an Tryptophan-Molekülen enthalten kann. Über die Detektion der sich ändernden Fluoreszenzintensität ist die Produktkonzentration eines Zielproteins, fusioniert mit dem W- tag (Fusionsprotein), qualitativ bestimmbar. Diese kurzen Tags sind 12-27 Aminosäuren lang (entspricht 5-11% der Größe von GFP)Während des Projektes wurden 5 verschiedene W- tags entwickelt und miteinander verglichen. Die W-tags wurden sowohl mit dem single-chain Antikörperfragment (scFv) Ki-4(scFv) , welches an den CD30 Rezeptor bindet, fusioniert als auch mit dem M12(scFv), welcher den MucI Rezeptor binden soll. Beide scFv sind potentielle pharmazeutisch relevante Zielproteine. Während der Expression und Kultivierung (durchgeführt in E.coli Rosetta2 (DE3)) der verschiedenen W-tags in MTPs, konnte eine Zunahme der Fluoreszenzintensität im Wellenlängenbereich der W-Tags mit der Produktbildung online gemessen werden. Bei gleicher Produktkonzentration konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass die Fluoreszenzintensität mit steigender Anzahl an Tryptophanen im W-tag ansteigt. Es ist gelungen ein Proof-of-Concept darzustellen, bei dem die Fusionsproteine sowohl innerhalb des Bakteriums quantitativ online vermessen werden können, als auch einzelsträngige Antikörperfragmente, die sich im Überstand der Bakterienkultur befinden. Die stark hydrophoben Eigenschaften der Aminosäure Tryptophan beeinträchtigen die Messung der Fluoreszenzintensität dabei nicht. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten, dass die Bindeaktivität des Ki-4(scFv) auf den CD30 –Rezeptor positiven L540cy Zellen durch die Anwesenheit des W-Tags nicht negativ beeinflusst wurde. Auch blieb die Fluoreszenz der verschiedenen W-Tags als Protein im Zellaufschluss der Produktionsorganismen erhalten, was ein 2D-Scan eindeutig bewies. Mit der Entwicklung der W-Tags ist es bei hohem Risiko gelungen ein erfolgreich nutzbares Messprinzip darzustellen, dass kurze Tags auf Basis aromatischer Aminosäuren zur quantitativen Proteindetektion verwendet. Es wurde gezeigt, dass ein Zielprotein mit W-Tag von einem nicht getaggten Protein unterschieden werden kann. Zusätzlich ist es sogar möglich, W-Tags mit einer unterschiedlichen Anzahl an Tryptophanen über ihre Fluoreszenzintensität voneinander zu differenzieren. Zudem wurde gezeigt, dass das ursprüngliche BioLector Messsystem zur prokaryotischen Expression auch zur Vermessung eukaryotischer Zellen geeignet ist. Dazu wurden rekombinate GFP-Fusionsproteine in CHO-Zellen transfiziert und in MTPs kultiviert, so dass die löslichen Proteine (u. a. Biomasse, Sauerstoffeintrag, usw.) parallel zu ihrer Produktion vermessen werden konnten.
