Entschlüsselung des katalytischen Mechanismus der [FeFe]-Hydrogenase durch Neutronenkristallographie

• Antragsteller: Jifu Duan, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 461338801

[FeFe]-Hydrogenasen katalysieren sehr effizient die reversible Umsetzung von Protonen (H+), Elektronen und molekularem Wasserstoff (H2) mittels ihres Eisen-Schwefel Cofaktors, des H-Clusters. Es wurden bereits große Fortschritte in der Aufklärung des katalytischen Mechanismus von [FeFe]-Hydrogenasen unter Anwendung von Röntgenstrukturanalysen, spektroskopischen Techniken, Elektrochemie und theoretischen Methoden erzielt. Viele Redoxzustände wurden identifiziert, wobei der Fokus auf der Charakterisierung der Elektronenkonfigurationen des H-Clusters lag. Demgegenüber wurden katalytisch wichtige Zustände des Wasserstoffs bisher kaum adressiert, da diese nur sehr schwer nachzuweisen sind. Im Rahmen dieses Projektes möchte ich Wasserstoffderivate in [FeFe]-Hydrogenasen direkt analysieren, insbesondere diejenigen, die an das H-Cluster binden, und die an Protonentransferpfaden beteiligt sind. Methodisch werde ich Neutronen- und Röntgenstrahlen-Kristallographie anwenden und diese mit der selektiven Anreicherung von Redoxzuständen kombinieren. Letztere sollen mittels Fourier-Transform-Infrarotspektrometrie (FTIR) an Proteinkristallen überprüft werden.Die Röntgenstrukturanalyse von CpI, der [FeFe]-Hydrogenase I von Clostridium pasteurianum, habe ich bereits etabliert. Um CpI-Kristalle für Neutronenkristallographie einsetzen zu können, müssen große Kristalle (>0.1 mm3) erzeugt werden. Kürzlich wurde dieses herausfordernde Ziel erreicht, welches die Grundlage für die Entwicklung dieses Projektes bildet. Die qualitativ hochwertigen Kristalle werden verwendet, um parallel hochauflösende Röntgenkristallstrukturen zu erhalten. Um in den Proteinkristallen gezielt stabile Redoxzustände einstellen zu können, insbesondere diejenigen, in vermutlich Wasserstoffderivate beteiligt sind, werden Enzymvarianten zum Einsatz kommen, in denen bestimmte stabile Endzustände erzwungen werden können. Hier sind etwa Polypeptidvarianten zu nennen, in denen der Protonentransferpfad verändert wurde. Weiterhin können auch chemisch synthetisierte Varianten des H-Clusters in die Enzyme integriert werden. Die meisten der angestrebten Redoxzustände werden chemisch eingestellt werden, etwa durch eine Änderung des pH-Wertes oder durch Reduktiuon mittels Dithionit. Kristall-FTIR wird dafür eingesetzt werden, die Einstellung der Zustände zu überprüfen. Schließlich werden die großen Kristalle in definierten Redoxzuständen am BIODIFF Neutronendiffraktometer vermessen. Die Diffraktionsdaten werden verfeinert, um Wasserstoffzustände lokalisieren zu können. Die eindeutige Zuordnung von Wasserstoffderivaten in verschiedenen Redoxzuständen wird es erlauben, die H-Cluster-Konfigurationen in diesen Zuständen zu charakterisieren. So könnte schließlich der Reaktionsmechanismus von [FeFe]-Hydrogenasen vollständig aufgeklärt werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen