Zeitaufgelöste Strukturanalysde der extended spectrum Beta-Lactamase CTX-M-14

• Antragsteller: Dr. Eike Schulz
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 458246365

Mit Hilfe zeitaufgelöster, serieller Synchrotron-Kristallographie (TR-SSX) plane ich die katalytischen Details des Reaktionsmechanismus der extended spectrum Beta-Lactamase CTX-M-14 zu ermitteln. Beta-Lactamasen vermitteln Resistenz gegen die weit-verbreiteten Beta-Lactam Antibiotika und spielen so eine wichtige Rolle bei der Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten. Bei der CTX-M-14 DT12 Beta-Lactamase handelt es sich um ein klinisches Isolat dieses Enzyms aus Klebsiella pneumoniae, das ein erweitertes Substratspektrum (ESBL) aufweist. Neben den Penicillinen können ESBL auch Cephalosporine und Monobactame hydrolytisch spalten und tragen so zur Resistenz gegen viele verschiedene Antibiotika bei. Das erste Ziel stellt die Ermittlung von Raumtemperaturstrukturen stabiler Reaktionsintermediate wie des Michaelis-Menten Komplexes, des kovalenten Intermediates sowie des Produktkomplexes, mittels serieller Synchrotronkristallographie dar. Diese statischen Raumtemperaturstrukturen bilden eine wichtige Basis zum Vergleich mit bekannten cryo-Strukturen sowie für den Vergleich der Reaktionsintermediate in zeitaufgelösten Röntgenbeugungsexperimenten. Über zeitaufgelöste Röntgenbeugung, via TR-SSX, plane ich die dynamischen Konformationsänderungen während der Katalyse zu untersuchen, die sich bisher nur aus statischen Cryo-Strukturen ableiten lassen. Zur Reaktionsinitiation werden Tröpfchen der Substratlösung auf Chip-immobilisierte Proteinmikrokristalle geschossen und dann Schnappschüsse der Reaktion in kurzen Zeitintervallen aufgenommen. Alternativ können optisch gekapselte Substrate zur Reaktionsinitiation eingesetzt werden. Zum Verständnis des katalytischen Mechanismus werde ich außerdem die kürzlich etablierte Burst-Serien Datensammlungsroutine einsetzen. Diese Serien ermöglichen eine Zeitauflösung von 1,35 ms und die Aufnahme von vielen Reaktionszeitpunkten in schneller Abfolge. Mit Hilfe dieser kurzen Zeitintervalle wird es möglich sein Strukturintermediate des Liganden während der katalytischen Reaktion zu verfolgen. Diese Expimente werden schließlich durch MD-Simulationen ergänzt, die die Zwischenschritte der Konformationsänderungen abbilden sollen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Dänemark
• Kooperationspartner: Professor Dr. Kresten Lindorff-Larsen, Ph.D.