Erforschung der Funktion des ORC-assoziierten Proteins LRWD1 in der Kopplung der DNA Replikation mit der Chromatinfaltung

• Antragsteller: Dr. Till Bartke
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 450084515

Die fehlerfreie Vererbung des genetischen Materials von einer Zelle zur anderen ist essentiell für Entwicklung und Überleben aller Organismen. Hierfür muss die DNA ein einziges Mal pro Zellzyklus verdoppelt und beide Kopien des Genoms gleichmäßig auf die Mutter- und Tochterzellen aufgeteilt werden. In höheren Eukaryoten startet die DNA-Synthese an zahlreichen Replikationsursprüngen, die in Replikationsdomänen co-reguliert werden. Man nimmt an, dass ausgewählte Replikationsursprünge in einer Replikationsdomäne durch Chromatin-Schleifen in direkte Nachbarschaft gebracht und zeitgleich aktiviert werden. Die Beweise hierfür sind jedoch nur indirekt und die molekularen Mechanismen, wie Replikationsursprünge festgelegt und koordiniert werden, sind nicht bekannt. Ziel dieses Projekts ist es, diesen Zusammenhang zwischen DNA Replikation und Chromatinstruktur zu ergründen.Replikationsursprünge werden durch den ‚Origin Recognition Complex’ (ORC) markiert, welcher auch das ORC-assoziierte Protein LRWD1/ORCA umfasst. LRWD1 ist an der Rekrutierung von ORC an das Chromatin beteiligt. Bei der Untersuchung der Funktion von LRWD1 bei der Etablierung von Replikationsursprüngen haben wir in Interaktionsstudien neben ORC die Cohesin-Untereinheit Smc3 als LRWD1 interagierendes Protein identifiziert. In ChIP-Seq-Experimenten zeigte sich, dass LRWD1 in hohem Maße mit Smc3 im Genom co-lokalisiert. Cohesin fungiert unter Anderem als ‚Looping-Faktor’ für Chromatin-Interaktionen zwischen weit entfernten genomischen Loci. Vergleiche unserer LRWD1 ChIP-Seq-Daten mit ‚Chromosome-Conformation-Capture’ Studien zeigen, dass LRWD1 Cohesin-basierte Chromatin-Schleifen markiert, die kürzer und andersgeartet sind als die langen Chromatin-Schleifen zwischen Chromatin-Domänengrenzen, die Cohesin zusammen mit dem ‚Boundary-Faktor’ CTCF bildet. Unsere Befunde deuten daher auf eine funktionelle Verbindung zwischen LRWD1, ORC und Cohesin, und somit auf eine direkte Verbindung zwischen DNA Replikation und Chromatin-Topologie hin. Auf diesen Ergebnissen aufbauend möchten wir nun die Mechanismen untersuchen, wie LRWD1 DNA-Replikation und Chromatinstruktur koppelt. Wir planen die Etablierung von Zellkultur-Modellen, mit denen wir LRWD1 mittels dCas9-Fusion an spezifische Stellen im Genom rekrutieren können, und mit denen wir LRWD1 und Cohesin während definierter Zellzyklusphasen induzierbar entfernen können. Wir werden diese Systeme zusammen mit ‚Chromosome-Conformation-Capture’, DNA-Replikations, und ChIP-Assays für ORC- und Prä-Replikationskomplexuntereinheiten, LRWD1 und Cohesin verwenden, um herauszufinden, wie Rekrutierung oder Entfernen von LRWD1 sich auf die Bildung von Replikationsursprüngen und auf die Chromatinfaltung auswirken. Diese Experimente werden es uns ermöglichen, die Zusammenhänge zwischen der Bildung von Replikationsursprüngen und der Chromosomenstruktur im Detail zu beschreiben, und aufklären, wie diese beiden Vorgänge auf molekularer Ebene miteinander verflochen sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen