Nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS): Verständnis der funktionellen Domänen-Interaktionen und der Direktionalität der Biosynthese mittels FRET-Spektroskopie

• Antragsteller: Professor Dr. Henning D. Mootz
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 434700456

Nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind sehr große Enzyme, die als Templat und Katalysator für die Biosynthese von vielen wichtigen peptidischen Naturstoffen dienen, darunter Daptomycin und Cyclosporin. Die einzelnen Aminosäurebausteine werden unter ATP-Verbrauch von Adenylierungsdomänen (A-Domänen) aktiviert, kovalent als Thioester am 4‘-Phosphopantethein-Arm der Peptidyl-Carrier-Protein-Domäne (PCP-Domäne) gebunden und durch Kondensationsdomänen (C-Domänen) miteinander verknüpft. Weitere Domänen wie die Epimerisierungsdomäne (E-Domäne) können für eine zusätzliche strukturelle Diversifizierung sorgen. Eine Thioesterasedomäne (TE-Domäne) setzt das fertige Produkt frei. In einer typischen linearen NRPS folgt die Zusammenstellung der Domänen einfachen Regeln. Um eine Aminosäure einzubauen sind alle notwendigen Domänen in einem Modul integriert und die Anordnung der Module in dem multifunktionellen Enzym entspricht der Reihenfolge der Aminosäuren im zu synthetisierenden Peptid. Im Gegensatz dazu ist nur sehr wenig über das zeitliche und räumliche Zusammenspiel von intramolekular angeordneten Domänen bekannt und wie sich dieses in die entscheidende Direktionalität beim schrittweisen Peptidaufbau übersetzt. Kristallstrukturen von NRPS-Multidomänen-Fragmenten haben wichtige Erkenntnisse geliefert, jedoch stellen sie nur statische Momentaufnahmen dar, denen Information zur Dynamik der Enzyme fehlt. Kürzlich haben wir den ersten FRET-Sensor eines vereinfachten NRPS-Konstruktes aus A- und PCP-Domänen konstruiert und konnten so konformationelle Änderungen des katalytisch aktiven Enzyms in Echtzeit mittels Zeit-aufgelösten Experimenten verfolgen. Diese Arbeiten führten bereits zu wichtigen neuen Erkenntnissen und Modellen. In diesem Projekt planen wir, das Konzept zum Studium von NRPS mittels FRET erheblich auszuweiten. Wir erwarten einen Erkenntnisgewinn hinsichtlich neuer mechanistischer Aspekte, die der direktionalen, NRPS-katalysierten Biosynthese zugrunde liegen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen