Entwicklung eines katalytisch perfekten Enzyms aus dem de novo konzipierten Metalloprotein MID1sc10 und Implementierung von neuen enzymatischen Aktivitäten in ein flexibles Gerüstprotein unter der Nutzung von gezielter Evolution und Austausch der komplexierten Metallionen

• Antragsteller: Dr. Dominic Hoch
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 430981304

Dieses Forschungsvorhaben zielt darauf ab, die Esteraseaktivität des Metalloproteins MID1sc10 soweit zu verbessern, dass ein katalytisch perfektes Enzym erhalten wird. Darüber hinaus ist es Ziel, neue enzymatisches Aktivitäten in ein flexibles Proteingerüst zu implementieren. In beiden Ansätzen werden rationales Design und gezielte Evolution zum Einsatz kommen. Das künstliche Peptidgerüst MID1sc, welches in diesen Studien benutzt wird, besteht aus zwei Helix-Turn-Helix-Motiven, einer Zink-Bindungsstelle und einer hydrophoben Tasche. Aufgrund der hohen Flexibilität des Gerüsts konnte es in der Vergangenheit in ein hochaktives Metalloprotein mit Esteraseaktivität evolviert werden. Das Gerüst MID1 zeigte eine leichte Phosphatase-Aktivität, was einen perfekten Ausgangspunkt für die Evolution dieser Struktur hin zu einem aktiven Enzym darstellt. Außerdem wird versucht mithilfe von rationalem Design Amidase-Aktivität in das Gerüst zu implementieren. Als Anfangspunkt wird untersucht, ob durch Austausch des komplexierten Metallions die jeweilige Aktivität (Phosphatase und Amidase) moduliert werden kann. Darauffolgend werden die neuen Strukturen gezielter Evolution unterzogen, um die Aktivitäten weiter zu verbessern und letztlich ein effizientes Enzym zu erhalten. Für beide Forschungsvorhaben wird die im Hilvert-Labor etablierte Fluoreszenz-basierte Mikrofluidik zum Einsatz kommen, die es erlaubt, DNA-Bibliotheken im Hochdurchsatzverfahren zu untersuchen. Um die zugrundeliegenden Mechanismen der Enzymkatalyse und -evolution zu verstehen, wird jede erfolgreich evolvierte Enzymvariante durch Röntgenkristallographie und Enzymkinetik-Messungen charakterisiert.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Schweiz
• Gastgeber: Professor Dr. Donald Hilvert