Strukturelle Untersuchungen an Lymphostatin

• Antragstellerin: Professorin Dr. Bettina Böttcher
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 428774170

Enteropathogene (EPEC) und enthohämoralgische (EHEC) E. coli Varianten verursachen systemische intestinale Erkrankungen. EPEC ist eine der führenden Ursachen für Diarrhöe in Kleinkindern in Entwicklungsländern. EHEC verursacht blutigen Durchfall mit lebensbedrohlichen Nierenkomplikationen und wird oft durch kontaminierte Lebensmittel übertragen. Ein gemeinsamer Schlüssel-Virulenzfaktor ist Lymphostatin, was das größte bis jetzt identifizierte Protein in E.coli ist. Lymphostatin ist ein Multidomänenprotein, das sowohl die Funktion von Lymphozyten im Wirt inhibiert als auch die bakterielle Anheftung an die Wirtszelle fördert. Eine der Domänen ist eine Glykosyltransferasedomäne (GT), wie sie ähnlich auch in anderen bakteriellen Toxinen, wie den großen Clostridium-Toxinen (TcdA/TcdB), gefunden wird. Die konservierte GT-Domäne entspricht aber nur einem kleinen Bereich von Lymphostatin in der N-terminalen-Hälfte, während die C-terminale Hälfte keine Homologie zu TcdA/TcdB zeigt und funktional und strukturell weitgehend unverstanden ist. Wir denken, dass in Lymphostatin verschiedene Funktionen durch konformatives Schalten und autoproteolytische Spaltung während der unterschiedlichen Phasen einer bakteriellen Infektion aktiviert bzw. deaktiviert werden.Um diese Hypothese strukturell zu testen, schlagen wir vor, cryo-elektronenmikroskopische Untersuchungen von Lymphostatin und seinen N- und C-terminalen Fragmenten mit und ohne gebundenem Substrat vorzunehmen. Dies wird klären, wo die GT-Domäne in Lymphostatin lokalisiert ist und ob Lymphostatin-spezifische Insertionen in der GT-Domäne entweder die Substratbindung modifizieren oder die Interaktion zwischen den Domänen beeinflussen können. Strukturvergleiche zwischen N- und C-terminalen Fragmenten mit vollständigem Lymphostatin werden zeigen, ob Maskieren und Demaskieren von Schlüsselbereichen ein möglicher Mechanismus des funktionalen Schaltens durch Autoproteolyse sein könnte.Es gibt Hinweise, dass Lymphostatin an bakteriellen Membranen lokalisiert ist. Wie es an diese Membranen bindet und ob es sie verändert ist unverstanden. Um dieser Frage nachzugehen, wollen wir Lymphostatin an Liposomen binden und die Proteoliposomen mit Kryo-Elektronentomographie und Subtomogrammmitteln untersuchen Dies wird zeigen, wie Lymphostatin die Membranen dekoriert und ob es die Membranen moduliert werden, beispielsweise durch Formen von Poren oder Läsionen. Unsere geplanten Untersuchungen werden die Architektur von Lymphostatin und das strukturelle Zusammenspiel der funktionalen Module aufklären. Wir erwarten, dass Lymphostatin durch einfache strukturelle Veränderungen und autokatalytische Proteolyse gesteuert wird und so zu einem Mehrzweckwerkzeug der bakteriellen Invasion wird. Detailliertes strukturelles Wissen über diese Mechanismen ist eine Grundvoraussetzung um die Wirkweise von Lymphostatin zu stören und so die verheerenden Wirkungen von EHEC und EPEC-Infektionen künftig zu minimieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen