21-Hydroxpregnan-21-O-Malonyltransferasen: Heterologe Expression in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae, Charakterisierung und Bedeutung für die Cardenolid-Biosynthese
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Hauptziel des Projektes bestand in der Identifizierung und Isolierung von Genen, die für Malonyltransferasen codieren welche in der Lage sind die Umsetzung von 21-Hydroxypregnanen zu katalysieren. Dabei wurden cDNAs von sieben unterschiedlichen Kandidatengenen (Atpmat1, Atpmat2, Ecmat1, Dlmat1, Dlmat2, Dlmat3, Dlmat4) isoliert, die jeweils Enzyme der BAHD Familie kodieren. Die Gene wurden dabei aus drei verschiedenen Pflanzenarten isoliert. Einerseits aus den beiden cardenolidhaltigen Pflanzen Digitalis lanata und Erysimum crepidifolium, wohingegen es sich bei der dritten Pflanze um die cardenolidfreie Modellpflanze Arabidopsis thaliana handelt. Fünf der sieben Kandidatengene konnten erfolgreich in E. coli exprimiert werden, wobei gezeigt werden konnte, dass alle verschiedene 21-Hydroxypregnane als Substrate akzeptieren. Verglichen mit den anderen Enzymen weißte AtPMaT1 wesentlich höhere spezifische Aktivitäten auf, wobei die 14β-hydroxylierten 21-Hydroxypregnane 3-O-Acetylketol und 3-O-Digitoxosylketol die präferierten Substrate darstellten. AtPMaT1 wurde als passender Kandidat betrachtet um in eine hefebasierte, biotechnologische Plattform eingeführt zu werden. Diese verfügt bereits über vier Gene, die in Kombination ein enzymatisches System ergeben, welches dazu in der Lage ist, Pregnenolon in Verbindungen zu überführen die in frühen Schritten der Cardenolidbiosynthese entstehen. Bei Fütterungsversuchen mit Pregnenolon zu dem neu formierten Konstrukt konnten jedoch keine malonylierten Produkte beobachtet werden, da das System nicht über eine 14β-Hydroxylase verfügt. Dementgegen konnte ein Produktumsatz von bis zu 23% beobachtet werden, wenn die AtPMaT1 alleine in Hefe exprimiert wurde und mit 14β-hydroxylierten 21-O-Pregnanen gefüttert wurde. Somit stellt Atpmat1 ein Kandidatengen dar, um die bereits etablierte biotechnologische Plattform zu erweitern, die noch durch den Schritt der 14β-Hydroxylierung vervollständigt werden muss.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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BAHD-like malonyltransferase genes from Digitalis lanata and Arabidopsis thaliana and their putative role in cardenolide biosynthesis. 67th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research (GA), Innsbruck, September 2019
M Tropper, S Höhn, J Munkert, W Kreis
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21-Hydroxypregnane 21-O-malonylation, a crucial step in cardenolide biosynthesis, can be achieved by substrate-promiscuous BAHD-type phenolic glucoside malonyltransferases from Arabidopsis thaliana and homolog proteins from Digitalis lanata. Phytochemistry 2021
Tropper M, Höhn S, Wolf L-S, Fritsch J, Kastner-Detter N, Rieck C, Munkert J, Meitinger N, Lanig H, Kreis W
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In silico, in vitro, and structural investigations on BAHD-enzymes from different species able to malonylate 21-hydroxypregnanes. 69th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research (GA), Bonn, September 2021
M Tropper, L-S Wolf, H Lanig, W Kreis
