Tuning of metabolic fluxes in Pseudomonas aeruginosa by the second messenger c-di-GMP
Parasitology and Biology of Tropical Infectious Disease Pathogens
Final Report Abstract
Pseudomonaden besitzen eine bemerkenswerte genetische sowie metabolische Plastizität, die es ihnen erlaubt, sich schnellen Veränderungen der Umwelt und Umgebung anzupassen. Pseudomonas aeruginosa (P.a.) ist in der Lage, verschiedenste Gewebe von Wirten zu kolonisieren und lebensbedrohliche akute sowie chronische Infektionen auszulösen. Im Verlauf dieses Projektes analysierten wir die Rolle, Regulation und mögliche Interaktionen mit sekundären Botenstoffen der drei paralogen Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenasen (GAPDH), einem Schlüsselenzym des zentralen Kohlenstoffmetabolismus. Unsere Ergebnisse weisen den einzelnen Paralogen funktionale Rollen zu. GapA sowie GapN sind essentiell für den glykolytischen Kohlenstoffmetabolismus, wohingegen GapB essentiell für den glukoneogenetischen Metabolismus ist. GapB nimmt eine spezielle Rolle ein, da P.a. glukoneogenetische Kohlenstoffquellen bevorzugt, weshalb wir uns auf dieses Enzym fokussierten. Erste Ergebnisse deuteten auf eine direkte Interaktion von GapB mit dem sekundären Botenstoff «zyklisches di-GMP» (cdG) hin. Wir waren in der Lage, die Proteinstruktur von GapB mittels Röntgenkristallographie aufzuklären, und konnten zeigen, dass GapB NADP(H) als Cofaktor und cdG als «Effektor» bindet. In Pseudomonaden reguliert cdG den Wechsel zwischen akuter Virulenz und Biofilmbildung und beeinflusst so den Lebensstil massgeblich; eine direkte Wechselwirkung des Metabolismus durch cdG wurde bisher noch nicht gezeigt. Bisher konnten auch wir in vitro keine direkte Veränderung der Enzymaktivität von GapB durch Bindung von cdG nachweisen. Wir konnten aber indirekt mittels Deletionsmutanten der verschiedenen GAPDH-Gene einen Einfluss des Metabolismus auf die Biofilmbildung zeigen, eine Verbindung die bisher noch nicht gezeigt werden konnte. Ein weiteres Ziel war es, zu verstehen, welche Rolle die verschiedenen GAPDH-Enzyme während einer Infektion haben und welche Art der Kohlenstoffquelle von P.a. für das Wachstum genutzt wird. Interessanterweise konnte eine gapB-Deletionsmutante die Larven der Wachmotte, Galleria mellonella, nicht mehr infizieren. Dieses Modell ist im Feld der Infektionsforschung anerkannt, weist jedoch klare Nachteile auf und kann bestimmte Fragestellungen nur bedingt beantworten. Aus diesem Grund haben wir ein künstliches Lungenmodell, das in unserem Labor entwickelt wurde, herangezogen und ein ähnliches Experiment aufgesetzt. Dieses hat das ursprüngliche Ergebnis des Wachsmottenmodells direkt bestätigt und den glukoneogenetischen Reaktionen des Metabolismus eine essentielle Rolle während einer Infektion zugeordnet. Zuletzt haben wir Reportersysteme für die einzelnen GAPDH-Gene entwickelt, welche in der sogenannten «mother machine» ihren Einsatz finden sollten. Dazu wurde P.a. genetisch so verändert, dass es für mehrere Tage kontinuierlich beobachtet und analysiert werden konnte, ohne grosse Mengen an Biofilm zu bilden. Durch die Kombination der «mother machine» und des veränderten P.a.-Stammes konnten wir zeigen, dass spezifische GAPDH-Proteinfunktionen in ihrer Genexpression widergespiegelt werden und so genutzt werden können, um die Direktionalität des zentralen Kohlenstoffmetabolismus auszulesen. Damit konnten wir analysieren, welche Kohlenstoffquellen P.a. in komplexen Medien und wirtsähnlichen Bedingungen nutzt. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass P.a. ein «metabolisches Gedächtnis» besitzt. Dieses Phänomen ist in Bakterien kaum verstanden, hat aber weitreichende Effekte im Menschen für dessen Altern sowie während der Entwicklung von Diabetes. Dieser Teil des Projekts wird Teil von nachfolgenden Forschungsarbeiten sein. Unser langfristig gestecktes Ziel beinhaltet zudem metabolische Prozesse im menschlichen Patienten vollständig aufzuklären und zu verstehen, um dieses Wissen dann zur Behandlung dieser Patienten nutzbar zu machen.
