Elucidation of the molecular mechanism of Cas-endonucleases from bacteria and cyanobacteria
Structural Biology
Final Report Abstract
Im Rahmen des Projekts sollten die molekularen Mechanismen von bakteriellen und archaealen Cas- Endukleasen untersucht werden. Deswegen haben wir unterschiedliche Gensequenzen verschiedener Cas- Endonukleasen zur heterologen Expression in E. coli kloniert. Während für die zwei archaealen Cas- Endonukleasen C2c8 und Cas12k keine lösliche Expression erzielt werden konnte, konnte die Expression und Aufreinigung von RcCas13a erfolgreich für weitere Studien optimiert werden. Die Struktur von RcCas13a im Komplex mit crRNA wurde mittels Protein Röntgenkristallographie bestimmt und zeigt das Enzym in seiner pre-Aktivierungs Konformation. Ebenso konnte der spezifische Erkennungsmodus von RcCas13a und der crRNA bestimmt werden. Basierend auf der Struktur wurden Punktmutationen eingefügt und die Aktiviaet dieser Mutanten mittels PAGE und Massenspektrometrie untersucht. Dies ermöglichte es uns Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Prozessierung der crRNA notwendig sind und erlaubte es uns einen Säure-Base katalytischen Mechanismus für die cRNA Spaltung durch RcCas13a zu postulieren. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass RcCas13a in E. coli sowohl komplementäre ssRNAs spaltet und folgend der Aktivierung durch ssRNA-Bindung auch Sequenz-unabhängige ssRNA degradiert. Die RNase Aktivität ist hierbei abhängig von den katalytischen Aminosäureresten der zusammengesetzten Aktiven Tasche, die durch die beiden HEPN-Domänen gebildet wird, als auch von der Basenpaarung der Ziel-ssRNA mit der Seed-Region der crRNA. Unsere Daten liefern weitere Einblicke in die molekularen Funktionsweisen dieser Familie von RNA-abhängigen RNasen, die bereits als effizientes Werkzeug für die RNA-Detektion und Regulation der Genexpression verwendet wird.
Publications
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Structure and mechanism of the RNA dependent RNase Cas13a from Rhodobacter capsulatus. Communications Biology, 5(1).
Kick, Leonhard M.; von Wrisberg, Marie-Kristin; Runtsch, Leander S. & Schneider, Sabine
