Molekulargenetische und funktionelle Untersuchungen zu dem Nicht-Lee kodierten Effektor A (NleA) von Shiga Toxin-produzierenden E. coli und seinen Varianten
Final Report Abstract
Der phagenkodierte Effektor NleA4795 des Shiga Toxin-produzierenden E. coli (STEC) O84:H4 Stammes 4795/97, der mit Hilfe des Locus of enterocyte effacement (LEE) kodierten Typ III-Sekretionssystems in eukaryotische Zellen transloziert wird, ist dort in der Nähe des Golgi-Apparats nachweisbar. Im Rahmen des beantragten Projekts sollten mit Hilfe verschiedener Deletionsmutanten Effekte von NleA in Wirtszellen und die Regulation der Genexpression von nleA bestimmt werden. Der genetische Hintergrund und die Mobilität des Gens nleA sollte ebenfalls untersucht werden. Untersuchungen hergestellter Deletionsmutanten zeigten, dass um je 20 AS verkürztes NleA4795 von den MutantenΔ2-Δ23 sekretiert wurde. Nur Mutante Δ1, die eine Deletion der N-terminalen AS aufweist, konnte kein NleA4795 sekretieren und translozieren. Bei der Analyse der subzellulären Lokalisation der verkürzten NleA4795-Proteine in HeLa-Zellen zeigten die vier Mutanten Δ9-Δ11 und Δ23 eine Golgi-Lokalisation ähnlich dem kompletten NleA4795-Protein. Dagegen war für die Deletionsmutanten Δ2-Δ8 und Δ12-Δ22 keine Golgi-Lokalisation, sondern eine Verteilung im Zytoplasma und Vesikeln sichtbar. Weiterhin konnte bei einer hohen Infektionsdosis in polarisierten Wirtszellen ein Abfall des transepithelialen Widerstands um ca. 60 % bei einer NleA-überexprimierenden Mutante festgestellt werden, was auf eine Beeinflussung der Tight Junctions durch NleA hindeutet. Die Arbeiten zu dem genetischen Hintergrund von nleA zeigten, dass die Umgebungsbereiche des sehr variablen Gens nleA recht konserviert sind und dieses Gen überwiegend in kryptischen Phagen vorliegt, insbesondere bei STEC klinisch wichtiger Serotypen. Die Gene kommen in allen untersuchten Phagen in Regionen mit weiteren Typ III-Effektorgenen und IS-Elementen vor. Bei der Untersuchung der Genexpression von nleA4795 zeigten Quorum sensing-Moleküle von E. coli keinen Einfluss und Norfloxacin eine Senkung der nleA4795-Expression. Bestimmte Salzkonzentrationen und ein reduzierter Nährstoffgehalt aktivierten die Expression von nleA4795, was einen Zusammenhang der nleA4795-Expression mit bakteriellen Stressantwort-Systemen zeigt. Die Analyse auf regulatorischer Ebene bewies die Abhängigkeit der nleA4795-Expression von den drei LEE-kodierten Regulatoren Ler, GrlA und GrlR sowie den Nicht-LEE kodierten Pch-Regulatoren. Für Ler konnte eine direkte Bindung an Bereiche der nleA4795-Promotorregion nachgewiesen und somit die Integration von nleA4795 in die Ler-vermittelte Regulation bestätigt werden.
Publications
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