Functional analysis of differentially regulated microRNAs in the canine intestinal T-cell lymphoma
Cell Biology
Final Report Abstract
In diesem Projekt sollte die Funktion von bestimmten microRNAs in Hunde-Zelllinien untersucht werden. Während solche Versuche zum Einfluß der microRNAs in vielen Zelllinien des Menschen und der Maus bereits beschrieben sind, gibt es dazu in Zelllinien des Hundes bisher keine Daten. Durch vorangegangene Experimente konnten wir mehrere microRNAs bestimmen, die in T-Zell-Lymphomen des Verdauungstrakts beim Hund besonders stark verändert exprimiert werden. Einige dieser microRNAs wurden bereits bei T-Zell-Lymphomen des Menschen und bei genetisch veränderten Mäusen mit T-Zell-Lymphomen als stark verändert exprimiert beschrieben und es wurde vermutet, dass sie bei der Tumorentstehung eine Rolle spielen. Für die Versuche zur Funktion der microRNAs beim Hund wurden zwei Zelllinien ausgewählt, eine Tumorzelllinie aus einem T-Zell-Lymphom des Hundes, und eine Zelllinie aus normalem Thymus-Gewebe des Hundes. Dann wurden verschiedene microRNAs in diesen Zellen überexprimiert oder gehemmt, indem microRNA-Analoga oder microRNA-Inhibitoren in diese Zellen eingeschleust wurden. Die Zellen wurden kultiviert und ihre Reaktion auf die microRNA-Überexpression und –Inhibition nach 48 Stunden gemessen, indem die Zellzahl bestimmt wurde, sowie der Anteil an lebenden Zellen und toten Zellen. Spezifische Effekte einzelner microRNAs konnten bei dieser Untersuchung nicht nachgewiesen werden. Die Zellen erwiesen sich als recht robust, allenfalls hohe Konzentrationen an transfizierter microRNA beeinträchtigten das Zellwachstum etwas. Weiterhin wurde in den transfizierten Zellen die Expression verschiedener Gene gemessen. Bei den T-Zell-Lymphomzellen des Hundes wurden von 13 getesteten Genen 11 exprimiert, allerdings ergaben sich keine wiederholbaren Expressionsänderungen in den behandelten Zellen. In den normalen Thymuszellen des Hundes wurden 12 der 13 getesteten Gene exprimiert, allerdings waren auch hier keine auffälligen Veränderungen der Expression nach Transfektion nachweisbar. In einem weiteren Experiment wurden Co-Transfektionen in den normalen Thymuszellen durchgeführt, bei denen Vektoren mit spezifischen microRNA-Bindungsstellen sowie microRNA- Analoga und –Inhibitoren in die Zellen eingeschleust wurden. Dabei sollte festgestellt werden, ob eine Funktionsänderung in diesen Zellen, gemessen durch eine Lumineszenz-Änderung, bei einer Bindung von microRNA an der Bindungsstelle nachgewiesen werden kann. Hier konnten moderate Änderungen bei der Transfektion nachgewiesen werden (bei der Co-Transfektion der Bindungsstelle NFAT5-3’UTR und dem miRNA-Analog Syn-cfa-miR-18b war die Lumineszenz um ca. 30% niedriger als bei der Co-Transfektion mit der entsprechenden Kontrolle, bei der Co-Transfektion der Bindungsstelle TCF4-3’UTR und dem miRNA-Analog Syn-cfa-miR-203 war die Lumineszenz ca. 40% höher als mit der entsprechenden Kontrolle). Zusammenfassend gab es bei der technischen Durchführung keine Probleme. Die verschiedenen Transfektionen von microRNA in die getesteten Hundezellen erbrachten keine deutlichen spezifischen Funktionsänderungen. Die beschriebenen Untersuchungen können als Grundlage für weitere Transfektionsexperimente mit diesen Hunde-Zelllinien dienen. Bei der Verwendung anderer Zielgene oder anderer microRNAs können möglicherweise spezifische Regulationsmechanismen nachgewiesen werden.
