PRPF8-RNA interactions in Retinitis pigmentosa - neue Krankheitsmodelle und quantitative iCLIP Methoden zur Untersuchung von Ursache und Konsequenzen fehlerhaften pre-mRNA Spleissens in neurogenerativen Erkrankungen

• Antragstellerin: Professorin Michaela Müller-McNicoll
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Humangenetik ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 391060249

Das Protein PRPF8 ist ein konservierter und ubiquitär exprimierter Spleißfaktor und agiert als Komponente des U5 snRNP (small nuclear ribonucleoprotein particle) im katalytischen Zentrum des Spleißosoms. Mutationen im menschlichen PRPF8 verursachen Retinitis pigmentosa (RP), eine autosomal dominante Retina-Erkrankung. Vorherrschende Pathologien sind ein Verlust der Photorezeptorzellen sowie degenerative Veränderungen des angrenzenden retinalen Pigmentepithels (RPE), welche schließlich zu vollständigem Erblinden führen. Wir konnten kürzlich zeigen, dass die meisten RP-assoziierten Mutationen in PRPF8 die Bindung an das U4/U6 di-snRNP-spezifische Protein SNRP200 stören und damit die Bildung des U4/U6/U5 tri-snRNP verhindern. Überraschenderweise jedoch verursacht die Mutation Y2334N ein Fehlspleißen nur von ausgewählten Transkripten ohne dabei die tri-snRNP-Bildung zu beeinflussen. Eine mögliche Begründung dafür ist, dass die Mutation Y2334N die Interaktion von PRPF8 mit spezifischen prä-mRNAs verändern könnte. Alternativ könnten besondere Sequenz- und/oder Struktur-Eigenschaften die Retina-spezifischen Transkripte anfälliger für eine limitierte Verfügbarkeit von funktionellem PRPF8 machen. Es ist höchstwahrscheinlich, dass die Retina-spezifischen Spleißveränderungen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Krankheit spielen, womit sich die betroffenen Prozesse als potentielle Therapieziele anbieten. Um dies zu überprüfen, werden wir ein Modellsystem für Spleißfaktor-RP entwickeln. Neben der Kultivierung von RPE-Zellen haben wir dafür die CRISPR/Cas9-Edierung etabliert, um GFP-markiertes PRPF8 mit der Mutation Y2334N vom endogenen Lokus aus zu exprimieren. Um Unterschiede in den RNA:Protein-Interaktionen und der Spleißleistung zwischen wildtypischem PRPF8 und der Y2334-Mutante in erkrankten RPE-Zellen zu quantifizieren, werden wir ein quantitatives iCLIP-Protokoll mit anschließender Analyse-Pipeline entwickeln. Parallel werden wir RNA-Seq-Experimente mit den erkrankten RPE-Zellen durchführen, um globale Veränderungen in RNA-Menge, Spleißleistung und alternativ gespleißten Isoformen zu messen. Dies wird offenlegen, ob die Spleißinhibition in der Tat selektiv ist, und Exons, Transkripte und molekulare Prozesse aufzeigen, die von der Mutation Y2334N betroffen sind und zur Entstehung und Ausprägung von RP beitragen könnten. Die Integration der iCLIP- und RNA-Seq-Daten sowie die in silico Analyse der betroffenen Zielgene, Spleißstellen und Introns wird uns Aufschluss über die Merkmale der Retina-spezifischen Spleißprozesse geben. Ausgewählte Zielgene oder Transkriptisoformen mit Krankheits-fördernden Eigenschaften werden wir in erkrankten RPE-Zellen funktionell validieren. Unsere Ansätze werden neue mechanistische Erkenntnisse liefern, wie ein zentraler Spleißfaktor selektiv das alternative Spleißen ausgewählter Zielgene regulieren kann, und uns helfen, die erhöhte Anfälligkeit dieser Transkripte für die RP-assoziierten Mutationen zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Tschechische Republik
• Partnerorganisation: Czech Science Foundation
• Kooperationspartnerin: Dr. Zuzana Cvackova