Entwicklung von Strategien zur Synthese rückgratcyclisierter Liganden für die N-Terminale SH2-Domäne der Protein Tyrosin Phoshatase SHP-1 und Ermittlung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen
Final Report Abstract
Peptide sind hoch wirksame und sehr selektive Wirkstoffe. Ihre therapeutische Anwendung erfordert in vielen Fällen eine Stabilisierung gegen den enzymatischen Abbau. Eine sehr effektive Methode dafür ist die Rückgrat-Zyklisierung. Sie belässt die zur Wirkungsauslösung erforderlichen Seitengruppen unverändert und karm die biologisch aktive Raumstruktur formen. Für bi- und auch einige trifunktionelle Aminosäuren wurde diese Methode beschrieben, jedoch nicht für Tyrosin (Y) bzw. phosphoryliertes Tyrosin (pY). Für die Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktion sind aber Peptide mit Y bzw. pY als Substrate oder Inhibitoren von Protein-Kinasen und -Phosphatasen sowie als Liganden für SH2- und PTB-Domänen von entscheidender Bedeutung. Der Versuch, Y- bzw. pY-Peptide mit Rückgrat-Zyklisierung zu synthetisieren ist deshalb von allgemeinerem Interesse und keineswegs auf die Darstellung von Oktapeptid-Liganden für die N-terminale SH2-Domäne der Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-1 beschränkt. Die im Rahmen dieses Projektes erhaltenen Ergebrüsse und die vorhandenen Erfahrungen bei der Darstellung rückgratzyklisierter Analoga der Peptidhormone Bradykinin und Somatostatin beweisen die Notwendigkeit, vorgeformte Dipeptid-Bausteine mit Y bzw. pY herzustellen. Da Vorversuche mit Phosphotyrosin-Derivaten gezeigt haben, dass zwar die reduktive Alkylierung dieser Derivate am Harz möglich, die Ankondensation der folgenden Aminosäure aber fast unmöglich ist, wurde der Aufbau der Peptide mit freier phenolischer Hydroxylgruppe durchgeführt. Es gelang, eine Serie von Pseudo-Dipeptiden mit N-Aminoalkyl-Tyrosin Fmoc-Aa'PICON( CH2)n-NH-Alloc]Tyr in guter Reinheit und Ausbeute herzustellen. Die Versuche zur Synthese von Dipeptiden mit N-Carboxyalkyl-Tyrosin Fmoc-Aa'¥(CO-N(CH2)n- COOAlllTyr bzw. mit acylierter reduzierter Peptid-bindung Fmoc-Aa'F[CH2-N(CO-R)lTyr verliefen dagegen trotz Einsatz der MUcrowelle und großer Überschüsse an Acylierungsreagenz erfolglos. Der Aufbau der Oktapeptid-Liganden am RINK-Amid-Harz bereitete durch die ungeschützte phenolische Hydroxylgruppe des Tyrosins erwartungsgemäß einige Schwierigkeiten. So erfolgte in einigen Fällen eine zu geringe Ankondensation, die freie Hydroxylgruppe wurde vorübergehend acyliert und eine N(R) "*" O-Acylwanderung fand statt. Während die Zyklisierungsreaktion problemlos verlief, musste die Phosphorylierung des Tyrosins wiederholt werden und führte zu uneinheitlichen Produkten. Nach deren Reinigung durch semipräparative HPLC kormten 6 phosphorylierte und am Rückgrat zyklisierte Oktapeptide gewormen und charakterisiert werden, allerdings in unterschiedlichen Mengen. H-Glu-Gly-Leu-Asn-NpTyr-Nle-Asp-Leu-NH2 (CH2)n X (pH2)m NH— Gly Diese zyklischen Peptide sind im Gegensatz zu den linearen stabil gegen den Abbau durch Proteasen (Chymotrypsin, Proteinase K, Homogenat aus NIH 3T3-Zellen). Damit erfüUen sie eine Voraussetzung für die Erprobung ihrer Wirksamkeit in lebenden Zellen und auch für einen möglichen Einsatz in der Signaltransduktionstherapie. Die Bestimmung der Aktivität und Selektivität der synthetisierten SH2-Liganden befindet sich noch in Arbeit.
